Pulmonale Bewertung. Lungenfunktionstests (PFT) wurden mit einem Brentwood Spirometer in unserem Büro durchgeführt. Einige Patienten hatten sich anderswo einer Untersuchung unterzogen.
Immuntest. Die Tests wurden in den Laboratorien von Immunosciences unter der Leitung von A. Wojdani, Ph. D., durchgeführt.. Angesichts der Bedeutung dieser Tests im Rahmen dieser Bewertung wird die Methodik ausführlich beschrieben.,
Herstellung von Formaldehyd-Humanserumalbumin (F-HSA) und Formaldehyd-Rinderserumalbumin (F-BSA)-Konjugaten:
Elektrophoretischer und immunelektrophoretischer Vergleich von HSA, BSA Mit F-HSA und F-BSA wurde durchgeführt, um das Auftreten von Konjugationen zu bestimmen. Die Konjugation wurde durch eine veränderte Mobilität von F-HSA, F-BSA im Vergleich zu HSA bzw. Darüber hinaus wurde die Anzahl der freien Aminosäuregruppen, die in der F-HSA oder F-BSA vorhanden sind, nach der Methode von Snyder und Sobocinski (1975) bestimmt und zur Beurteilung der Substitutionsmenge verwendet., Die Anzahl der an Formaldehyd gebundenen Aminogruppen betrug 26 für HSA und 31 für BSA. In diese Berechnung, die Bildung von intermolekularen Vernetzung betrachtet wurde.
Herstellung von Toluoldiisocyanat-Humanserumalbumin (TDI-HSA) – und Rinderserumalbumin (TDI-BSA) – Konjugaten:
Diese Zubereitung ähnelte den Methoden von Dewar und Baur (1982). Nach diesem Verfahren wurde 1g HSA oder 1g BSA in 100 ml einer Pufferlösung mit Kaliumchlorid (0,05 mol/l), Natriumborat (0,05 mol/l), PH 9,4 gelöst und auf 4 C abgekühlt Dioxan (10 ml) mit 0.,15 ml Toluoldiisocyanat wurden dann tropfenweise unter Rühren über einen Zeitraum von 3 Stunden zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 2 ml Ethanolamin, Zentrifugation, Dialysefiltration und Lyophilisierung. Ähnlich wie bei F-HSA und F-BSA wurde die Konjugation durch Elektrophorese und Bestimmung der im Konjugat vorhandenen freien Aminogruppen bestätigt. Die Anzahl der an TDI gebundenen Aminogruppen betrug 37 für HSA und 43 für BSA. Zusätzlich wurde eine spektrographische Analyse des Konjugats nach Zeiss et durchgeführt. Al. (1980)., Es gab einen deutlichen Anstieg der Absorption von 230 auf 260 nm, was darauf hindeutete, dass TDI kovalent mit dem Proteinträger verbunden war. Diese Erhöhung der Resorption stimmte mit der NH2-Gruppenbestimmung nur 76% für HSA und 81% für BSA
überein Zubereitung von Trimellitaanhydrid-Humanserumalbumin (TMA-HSA) und Trimellitaanhydrid Rinderserumalbumin (TMA-BSA):
Zur Herstellung dieser Konjugate 25 mg. von TMA wurde in 0,5 ml Dioxan gelöst und tropfenweise entweder zu 25 mg HSA oder BSA in 5 ml kaltem 7% NaHCO3 in Wasser gelöst., Nach 60 Minuten Rühren bei 4 ° C wurden die Konjugate gegen vier Änderungen von 0,1 M NaHCO3 und einen Pufferwechsel dialysiert. Schließlich wurden die Konjugate filtriert und bis zur Verwendung bei -20 C gehalten. OD-Analysen von TMA-HSA und TMA-BSA wurden durchgeführt, um die Anzahl der mit dem entsprechenden Trägerprotein verbundenen TMA-Rückstände zu bestimmen. Die Konzentration des Trägerproteins wurde mit dem Molekulargewicht von HSA und BSA in molare Konzentration umgewandelt. Aus dem Verhältnis der molaren Konzentration des TMA-Liganden und des Proteinträgers wurde das Verhältnis der TMA-Reste pro Trägermoleküle berechnet., Es wurde geschätzt, dass TMA-HSA 5 TMA-Rückstände pro HSA-Molekül und für TMA-BSA sieben Rückstände pro Albuminmolekül enthielt (Pien et al., 1988).
Herstellung von Phthalsäureanhydrid-Humanserumalbumin (PA-HSA) und Phthalsäureanhydrid Rinderserumalbumin (PA-BSA)-Konjugaten:
Diese Hapten-Konjugate wurden durch Zugabe von 75 mg PA zu einer gekühlten Lösung von 300 mg HSA oder BSA in 100 ml H2O hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt, gegen 0,1 M PBS dialysiert, wobei Schläuche mit einem Cutoff von 8000 Dalton verwendet wurden. Mit der Methode von Zeiss et. Al. (1977) die molaren Verhältnisse wurden berechnet., Die molare Verhältnisse gefunden wurden, werden 22/28 für PA/HSA und 25/30 für PA/BSA.
Herstellung von Benzolring – HSA (B-HSA)-und Benzolring-BSA (B-BSA) – Konjugaten:
Für diese Zubereitungen 40 mg. von P-Aminobenzoesäure wurde in 2 ml 1 N HCL gelöst und durch Eintauchen in ein Eisbad abgekühlt. Eine kalte Lösung von 14 mg/ml wurde tropfenweise zugegeben. Nach jeder Zugabe wurde die Mischung 30 Sekunden lang gerührt. Parallel dazu wurde ein Gramm HSA oder BSA in Borsäure 0,16 M Natriumchlorid (0-15 M) Puffer PH 9,0 gelöst (PH wurde mit NaOH erhöht)., Die Becher, die die Lösungen von Albuminen enthielten, waren von einem Eisbad auf Magnetrührer umgeben. Die Lösung von Diazoniumsalz wurde tropfenweise unter schnellem Rühren zu der kalten Proteinlösung gegeben. Nach Zugabe jedes Tropfens wird der PH-Wert mit einem normalen NaOH auf 9,0 bis 9,5 nachjustiert. Wenn die gesamte Lösung zugegeben worden war, durfte die Reaktion unter langsamem Rühren für mindestens eine Stunde mit weiteren Zusätzen von NaOH-Lösung fortgesetzt werden und der PH-Wert im Bereich von 9,0 bis 9,5 gehalten werden., Nicht umgesetzte kleine Moleküle wurden durch ausgedehnte Dialyse oder durch Passage durch eine Säule von Sephadex G-25 im kalten Raum mit einer isotonischen Salzlösung als Elutionspuffer entfernt. OD-Analysen der Orangenfarbentwicklung von B-HSA und B-BSA wurden durchgeführt, um die Anzahl der mit dem entsprechenden Trägerprotein verbundenen B-Rückstände zu bestimmen. Die Menge an BSA für HSA betrug ungefähr 41 und für BSA 53 (Migrdichian, 1957).
Antikörperbestimmung:
Spezifische Antikörper gegen F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA und B-HSA wurden mit einem nicht wettbewerbsfähigen ELISA-Assay analysiert., Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Dynatech, Alexandria, VA) wurden mit 100 1 Antigenlösungen (100 g/ml) in 0,1 M PBS PH 7,2 über Nacht bei 4 C beschichtet Platten wurden 4 mal mit 0,1 M PBS mit 0,05% tween 20 zwischen jedem Schritt gewaschen. Freie Absorptionsstellen wurden mit 2% proteasefreiem Rinderserumalbumin bei Raumtemperatur für 4 Stunden blockiert und bis zur Verwendung bei -20 C gelagert.,
Analyseverfahren:
Das Verfahren umfasste Folgendes: (1) viermaliges Waschen, (2) Zugabe von 100 1 verdünntem Serum (1:2 für IgE und 1:100 für IgM und IgG) in PBS tween-20 mit 1% BSA (3) Inkubation für 4 Stunden bei 20 C, gefolgt von Waschen 4 mal, (4) Zugabe von 100 1 einer optimalen Verdünnung von alkalischer Phosphatase markierter Affinität gereinigt durch Anti-Human-IgE ( ) (1:200), IgM (1:1:500) und anti IgG (1: 1000), gekauft von KPI (Maryland) (5) Inkubation für 120 Minuten bei 20 C, (6) Waschen 6 mal, (7) Zugabe von 100 1 von P-Nitrophenylphosphat (Sigma Chemical Co.,) (8) Inkubation für 60 Minuten bei 20 C (9) Zugabe von 50 1 von 3 N Natriumhydroxidlösung, und (10) doppelte Lesung. Die Ergebnisse wurden basierend auf Absorptionen von Doppelproben von 405 nm unter Verwendung eines Mikrotiterlesers berechnet. Alle Proben wurden gegen ein HSA-Antigen als Kontrolle der Bindung gelesen, die nicht spezifisch für F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA und B-HSA ist. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als titer. Titer ist die letzte verdünnung von serum geben absorption zweimal von HSA control.,
Spezifitäts-und Kreuzinhibitionsstudien:
Zur Bestimmung der Antikörperspezifität wurde eine Kreuzinhibitionsstudie durchgeführt. Positive Seren für jedes Hapten-Protein-Konjugat wurden nach entsprechender Inkubation und Ausfällung mit zehnfach zunehmenden Inkrementen von Hapten-gebundenem HSA oder BSA als Inhibitoren durchgeführt, um den Bereich des Antikörper-Antigen-Überschusses abzudecken. Dieser Bereich lag zwischen 50 g bis 1000 g für Hapten-BSA und 80 g bis 1000 g für Hapten-RSA., Nach Inkubation bei 37 ° C und Entfernung des Niederschlags durch Zentrifugation wurden die Proben aus der Kreuzinhibitionsstudie dann auf Platten mit Vertiefungen gelegt, die mit dem spezifischen Konjugat beschichtet waren. Die nachfolgenden Schritte wurden wie oben für die ELISA-Studie beschrieben befolgt.
Die Bindung von IgG-und IgM-Antikörpern an verschiedene Konjugate wurde durch Hapten-HSA oder Hapten-BSA von 36-85% gehemmt. Bei einer gegebenen Konzentration hemmten sowohl Hapten-HSA als auch Hapten-BSA den Antikörperspiegel auf ähnliche Weise.,
Eine partielle Hemmung der IGE-Antikörperbindung an verschiedene Haptenkonjugate wurde beobachtet, wenn das Serum mit Hapten-HSA oder Hapten-BSA vor inkubiert wurde. Diese unvollständige Beobachtung der Hemmung des IgE-Antikörpers stand hauptsächlich im Zusammenhang mit der Nichtverfügbarkeit von Serum mit hohen IgE-Titern gegen verschiedene Chemikalien in unserem Labor.,
Bestimmung normaler Antikörperspiegel (Kontrollen):
Auf der Grundlage der oben genannten Verfahren wurden 160 Blutspenderproben gesunder Personen beiderlei Geschlechts im Alter zwischen 22 und 55 Jahren auf Antikörperspiegel gegen F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA und B-HSA untersucht. Der durchschnittliche Titer betrug 1: 800 400 für IgG, 1:3200 1600 für IgM und 1:8 4 für IgE. Daher werden in unserem Labor Titer größer als 1:1600 für IgG, 1:6400 für IgM und 1:16 für IgE als positiv angesehen.,
Bei einem gegebenen Patienten wurde ein Anstieg oder Abfall der Antikörpertiter um mehr als eine Verdünnung als signifikant angesehen (siehe Tabellen).
Lymphozyten-Teilmenge Aufzählung:
Ein einzelnes Laser-Durchflusszytometer (Epics-Profil: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL), die vorwärts-und rechtwinklige Lichtstreuung sowie zwei Farben unterscheidet, wurde mit einem Softwarepaket (Quad Stat: Coulter) verwendet. Mononukleäre Zellpopulationen wurden durch zweifarbige direkte Immunfluoreszenz unter Verwendung einer Vollblut-Färbetechnik mit dem entsprechenden monoklonalen Antikörper und der Durchflusszytometrie bestimmt (Fletcher et al.,, 1989) Wurden folgende Paare von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE)-konjugierten monoklonalen Antikörpern (Coulter immunology) ausgewählt: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI und T11-FITC/Tal-PE zur Bestimmung von T-Zell/B-Zelle, T-Helfer/T-Suppressor, NKHT3+ /NKHY3 und für alternative Wege der Lymphozytenaktivierung bzw.
Zur Überwachung von Lymphozytenmarkern wurden BVT-Karten für die Lymphozytenpopulation der Vorwärtswinkellichtstreuung im Vergleich zu einem 90-Lichtstreuhistogramm festgelegt., Der Prozentsatz der positiv gefärbten Zellen für jedes Markerpaar sowie der Prozentsatz der doppelt gefärbten Zellen wurde bestimmt. Schätzungen der absoluten Anzahl positiver Lymphozyten für die jeweiligen Oberflächenmarker wurden durch Multiplikation der Anzahl peripherer Lymphozytenzellen mit dem Prozentsatz positiv gefärbter Zellen für jedes Markerpaar bestimmt. Auch der Prozentsatz der doppelt gefärbten Zellen wurde bestimmt., Schätzungen der absoluten Anzahl positiver Lymphozyten für die jeweiligen Oberflächenmarker wurden durch Multiplikation der Anzahl peripherer Lymphozytenzellen mit dem Prozentsatz positiver Zellen für jeden Oberflächenmarker bestimmt.
Messung von Anti-Myelin-basischen Proteinantikörpern:
Humanes Myelin-basisches Protein (HMBP) wurde nach der Methode von Diebler et al. (1972) und auf Reinheit durch Polyacrylamingelelektrophorese überprüft. Antiserum zu HMBP wurde bei Kaninchen durch wiederholte Injektion von HMBP in komplettes Freund-Adjuvans induziert., Die Antikörperaktivität in den Kaninchen-Seren und Patientenproben wurde durch Zugabe verschiedener Verdünnungen (1:100 bis 1:10.000) von Seren zu Vertiefungen einer zuvor mit HMBP beschichteten Mikrotiterplatte wie folgt nachgewiesen: HMBP 250 g/ml wurde in Carbonatpuffer gelöst, PH 9,6 und 200 l dieser Lösung wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach Inkubation, Waschen und Blockieren wie oben wurden 200 mg entweder verdünntes Kaninchen-oder Menschenserum in die Vertiefungen gegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 ° C wurden die Seren aus den Vertiefungen geschüttelt und anschließend 5 mal mit Waschlösung gewaschen., 200 1 von Peroxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen – oder Ziegen – Anti-Human-IgG, IgM oder IgA (optimale Verdünnung) wurden in die entsprechende Vertiefung gegeben. Nach Inkubation und wiederholtem Waschen wurden 200 ml ABTS-Substrat in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und in einem Mikrotiterleser bei 405 tun Wellenlänge gelesen. Unter Verwendung von Kaninchen-Antisera; Eine Titrationskurve wurde aufgetragen und die Seren des Patienten wurden mit dieser Standardkurve verglichen., Basierend auf mehr als 200 Kontrollen und Patientenprobenbestimmungen wurden Werte von mehr als 1:2000 für IgA, 1:5000 für IgM und 1:8000 für IgG als positiv angesehen.