Úvod do RNA-seq

sekvenování RNA (Wang 2009) rychle nahrazuje mikroarény genové exprese v mnoha laboratořích. RNA-seq umožňuje kvantifikovat, objevovat a profilovat RNA. Pro tuto techniku jsou mRNA (a další RNA) nejprve převedeny na cDNA. CDNA se pak používá jako vstup pro přípravu knihovny sekvenování nové generace. V tomto článku uvedu stručný přehled RNA-seq a představím hlavní metody, které se dnes používají.

proč je RNA-Seq „lepší“ než Mikroarrays?,

existuje několik výhod, které má RNA-seq oproti mikroarrays:

s RNA-seq můžete vyslýchat více než jen diferenciální genovou expresi. Ačkoli existují mikroarrays k dispozici pro exon-level a microRNA analýzy, většina uživatelů jsou stále zájem o základní, pravděpodobně 3 ‚ zaujatý, diferenciální genové exprese. S RNA-seq se můžete podívat na kódující a nekódující RNA, sestřih a alela konkrétní výraz, a možná brzy na full-délka cDNA sekvencí, což eliminuje potřebu odvodit, nebo sestavit izoformy.,

Mikroarrays jsou také zkreslené, protože se musíme rozhodnout, jaký obsah umístit na pole. Protože RNA-seq nepoužívá sondy ani primery, data trpí mnohem nižšími předsudky(i když nechci říci, že RNA-seq nemá žádné).

RNA-seq poskytuje digitální data ve formě vyrovnaných čtecích počtů, což vede k velmi širokému dynamickému rozsahu, což zlepšuje citlivost detekce vzácných přepisů.

je také velmi nákladově konkurenceschopný vůči mikroarrays, protože dnes lze mezi 6-30 vzorky multiplexovat v jediném sekvenačním pruhu Illumina.,

nakonec můžete znovu analyzovat datový soubor RNA-seq, jakmile budou k dispozici další informace o transkriptomu. Pokud dokument je zveřejněn ukazuje zajímavý splice-varianta v podobné systému, který jste v práci, pak možná budete chtít jít zpět a podívat se na to, že sestřih ve vašem vzorky; a vy byste již mít data, aby tak učinily.

jak funguje RNA-Seq?

existuje mnoho metod pro provádění experimentu RNA-seq. Ve skutečnosti se techniky vyvíjejí tak rychle, že může být obtížné rozhodnout, který z nich použít., Základní volba je mezi 1) náhodná syntéza cDNA z dvojvláknové cDNA nebo 2) metody ligace RNA (přezkoumáno a porovnáno v Levinu 2010). Většina lidí používá první metodu a pak je třeba provést další volbu mezi protokolem specifickým pro vlákno a protokolem, který není. Nejčastěji používanou metodou v mé laboratoři je Illumina TruSeq RNA-seq,což je náhodná syntéza cDNA nespecifický protokol.

jakmile máte sekvenční knihovnu, je sekvencována do zadané hloubky, která závisí na tom, co chcete s daty dělat., Tyto hodnoty jsou zarovnány do genomu nebo transcriptome a jsou počítány k určení diferenciální genové exprese nebo dále analyzovat a zjistit, sestřih a izoformy výraz. Většina lidí sekvenuje RNA pomocí párových metod 50-100bp. Výjimkou je mikroRNA sekvenování, protože to ve většině případů vyžaduje pouze jednokoncové sekvenování 36bp.

Naše RNA-Seq Metody

použijeme mezi 100 ng-1 µg celkové RNA jako vstup do mRNA zachytit s oligo-dT potažené magnetické korálky. MRNA je roztříštěná a pak se provede syntéza cDNA s náhodným základním nátěrem., Výsledný double-strand cDNA je použit jako vstup do standardní Illumina library prep, který zahrnuje end-opravy, adaptér ligace a amplifikace metodou PCR, aby vám knihovny připravené pro sekvenování.

proč se obtěžovat s informacemi o pramenech?

o anti-sense transkripci a jejím biologickém významu se hodně diskutovalo. Pokud máte zájem o jednoduchou diferenciální genové expresi, pak pramen informací nebude přidávat moc, aby svůj experiment, ale bude váš protokol složitější., Poté, co jste to řekli, můžete provést nejrozšířenější metodu bez přílišného úsilí. Chcete-li to provést, během syntézy 2.pramene cDNA použijte uracil pro inkorporaci místo thyminu. Postupujte podle Illumina knihovny prep jako obvykle, ale po ligaci adaptéru a před amplifikací PCR přidejte uracil-dna glykosylázu k degradaci 2ndstrand. To má za následek, že všechny čtení začínají ve stejné orientaci, takže můžete určit, který pramen byl ve vašem vzorku přepsán.

co můžete skutečně dělat s RNA-Seq?,

RNA-seq je výkonný a všestranný nástroj publikovaný v posledních několika letech. Vybral jsem si pár svých oblíbených (některé z práce provedené v jádru zařízení se mi podaří) pro ilustraci toho, co můžete dělat s RNA sekvenování.

• Jabbari, et al. používá se RNA-seq k vyšetření psoriázy a nalezení nových genů pro funkční analýzu. Porovnali svá data RNA-seq s publikovanými studiemi a našli 1700 nových kandidátů. Ty byly validovány qPCR a srovnání s funkčními databázemi pro psoriázu podporovalo jejich roli v patogenezi.
• Kutter, et al., použité RNA-seq ve studii zkoumající zachování vazby RNA polymerázy III u savců k ověření exprese genů obsazených Pol III, jak bylo testováno ChIP-seq.
• Mercer, et al. kombinované zachycení založené na RNA-seq a mikroarray k identifikaci a charakterizaci vzácných přepisů, které jsou obvykle Nedetekovatelné. Cílené přepisy se postupně zvyšovaly z 0,21% před zachycením na 80% po zachycení., Našli více než 200 dříve neanotovaných izoformů pro téměř 50 lokusů kódujících bílkoviny, včetně nového alternativního izoformu TP53,což je velmi dobře charakterizovaný gen. To naznačuje, že v genomu a transkriptomu je stále ještě velká složitost, která má být vyřešena.

stručně řečeno, RNA-seq je stále vyvíjejícím se nástrojem, ale ve většině případů je výhodnější než mikroarrays. Je citlivější, robustnější a může být nákladově efektivnější. Jaké projekty RNA-seq nyní plánujete pro svůj projekt?,

Jabbari et al: Transkripční profilování psoriázy pomocí RNA-seq odhaluje dříve neidentifikované diferenciálně exprimované geny. Žurnál vyšetřovací dermatologie 2011.

Kutter et al: vazba Pol III u šesti savců vykazuje zachování mezi aminokyselinovými izotypy navzdory divergenci mezi geny tRNA. Nature Genetics 2011.

Levin et al: komplexní srovnávací analýza sekvenačních metod RNA specifických pro řetězce. Nature Methods 2010.

Mercer et al: cílené sekvenování RNA odhaluje hlubokou složitost lidského transkriptomu. Přírodní Biotechnologie 2012.,

Wang et al: RNA-Seq: revoluční nástroj pro transkriptomiku. Nat Rev Genet 2009.

původně publikováno 25. května 2012. Aktualizováno a revidováno 16. srpna 2015.