Co je průtoková cytometrie (analýza FACS)?

Původně vyvinut v pozdní 1960, průtoková cytometrie je populární analytické buněk-biologie technika, která využívá světlo počítat a profil buněk v heterogenní kapalná směs. Průtoková cytometrie je velmi účinná metoda, protože umožňuje výzkumník rychle, přesně a jednoduše shromažďovat údaje vztahující se k mnoha parametrů, z heterogenní kapalná směs obsahující živé buňky.,

průtoková cytometrie se používá rozsáhle po celou dobu života a biomedicínských věd a může být použita v jakémkoli scénáři, kdy výzkumník potřebuje rychle profilovat velkou populaci volných buněk v kapalném médiu. Například v imunologii se průtoková cytometrie používá k identifikaci, oddělení a charakterizaci různých podtypů imunitních buněk na základě jejich velikosti a morfologie.

pokud jsou vyžadovány další informace, protilátky označené fluorescenčními barvivy a zvýšené proti vysoce specifickým antigenům buněčného povrchu (např., klastry diferenciace nebo markerů CD) lze použít k lepší identifikaci a segregaci specifických subpopulací ve větší skupině.

v průtokovém cytometru

• vzorkové buňky procházejí úzkým kanálem jeden po druhém.
• světlo se používá k osvětlení buněk v kanálu.
• řada senzorů detekuje typy světla, které jsou lámány nebo emitovány z buněk.
• data získaná senzory jsou sestavena a integrována pro vytvoření komplexního obrazu vzorku.,

FACS Protilátky v současné době používá pro Výzkum

Různé Typy osvětlení používané v Průtokové Cytometrie Experiment

průtokový cytometr používá lomené nebo vyzařované světlo se počítat a identifikovat buňky. Další informace o různých typech světla používaných v experimentu s průtokovou cytometrií na následujících obrázcích.,

Forward Scatter

Dopředu rozptýlené světlo láme buňkou v toku kanálu a pokračuje podél dráhy světla (tj. Ve stejném směru, že světlo bylo původně na cestách). Dopředné rozptýlené světlo je detekováno senzorem ve světelné cestě a obvykle se používá k identifikaci velikosti částic.

dopředné rozptýlené světlo se nejčastěji používá k detekci velikosti objektu ve světelné cestě., Větší objekty bude produkovat více dopředu rozptýlené světlo než menší objekty, a větší buňky mají silnější forward scatter signál

Boční Rozptyl

Boční rozptýlené světlo světlo prochází ze zdroje osvětlení do průtokového kanálu, je lomený do buňky ve směru, který je mimo původní světelné dráhy. Boční rozptýlené světlo je detekováno senzorem, který je ortogonální k původní světelné cestě.,

boční rozptýlené světlo se obvykle používá k určení zrnitosti a složitosti buňky ve světelné cestě. Vysoce zrnité buňky s velkým množstvím vnitřní složitosti, jako neutrofily, budou produkovat více světla rozptýleného na straně a vyšší signál rozptýleného na straně než buňky s nízkou granularitou a složitostí.

Fluorescenční Emise

Fluorescenční světlo je emitované fluorescenční molekuly po excitaci pomocí kompatibilního vlnové délce laseru., Fluorescenční světlo může pocházet z přirozeně fluoreskující materiály v buňce, nebo může pocházet z fluorescenční barviva nebo fluorescenční-označené protilátky, které byly použity k označení určité struktury v buňce.

Multiparametric Analýzy

mock průtoková cytometrie dot-plot, kreslení vpřed vs boční-rozptýlené z populace leukocytů., Populace buněk jsou označeny jejich pravděpodobnou identitou:

d předpokládané trosky, velmi malé předměty s nízkým nízkým dopředným a bočním rozptylem.

L/M pravděpodobné leukocyty / monocyty, malé až střední buňky s nízkou vnitřní složitostí / granularitou. Tyto buňky vytvářejí střední dopředný rozptyl a nízkou intenzitu signálu s bočním rozptylem

G pravděpodobné granulocyty, velké buňky s vysokou vnitřní složitostí / granularitou. Tyto buňky generují signály s vysokým dopředným a bočním rozptylem.,

zatímco některé identity mohou být potvrzeny profily dopředného a bočního rozptylu, označování specifickou značkou buněčného typu vždy poskytuje větší rozlišení a jistotu při profilování komplexních heterogenních populací buněk.

například na výše uvedeném grafu může být výzkumník schopen rozlišovat mezi granulocyty a lymfocyty pomocí dopředného a bočně rozptýleného světla. Nicméně tři třídy granulocytů (neutrofily, bazofily a eozinofily) jsou velmi podobné velikosti a struktuře, což jim dává podobné vlastnosti rozptylu světla., V tomto případě by neutrofily mohly být selektivně označeny na základě jejich exprese specifickým markerem neutrofilů, jako je Elan.

FACS: třídění buněk na základě údajů o průtokové cytometrii

pojmy průtoková cytometrie a třídění buněk aktivovaných fluorescencí (FACS) se často používají zaměnitelně. V praxi existují rozdíly mezi oběma metodami.

FACS je derivát průtokové cytometrie, který přidává výjimečný stupeň funkčnosti. Pomocí FACS může výzkumník fyzicky třídit heterogenní směs buněk do různých populací.,

pomocí vysoce specifických protilátek označených fluorescenčními barvivy může výzkumník provádět analýzu FACS a současně shromažďovat data a třídit vzorek téměř neomezeným počtem různých parametrů.

v experimentu FACS:

• Forward-scatter, side-scatter a fluorescenční data se shromažďují, stejně jako v konvenční průtokové cytometrii.
• uživatelem definované parametry poskytují informace o tom, jak mají být buňky seřazeny.
• na základě těchto parametrů používá stroj FACS elektrodu k uložení elektrického náboje na každou buňku.,
• po opuštění průtokové komory budou elektromagnety třídit buňky podle náboje do samostatných nádob.

jak vypadají údaje o průtokové cytometrii?

v experimentu s průtokovou cytometrií bude každá buňka, která prochází průtokovým cytometrem a je detekována, klasifikována jako zřetelná událost.

Navíc, každý druh světla, který je detekován průtokovým cytometrem (forward-scatter, side-scatter, a každá vlnová délka fluorescence je emise) bude přidělen svůj vlastní jedinečný kanál., Průtoková cytometrická data vykreslí každou událost nezávisle a budou představovat intenzitu signálu světla detekovaného v každém kanálu pro každou událost.

průtoková cytometrie údajů je obvykle reprezentována v jednom ze dvou způsobů: histogramy, které měří nebo porovnat pouze jeden parametr, a dot-pozemky, které porovnat 2 nebo 3 parametrů současně na dvou – nebo tří-dimenzionální scatter-plot.

histogram obvykle vykresluje intenzitu detekovanou V jednom kanálu podél jedné osy a počet událostí zjištěných při této intenzitě je v samostatné ose., Velké množství událostí zjištěných při jedné konkrétní intenzitě se zobrazí jako hrot na histogramu.

naproti tomu v bodovém grafu je každá událost reprezentována jako jediný bod na rozptylovém grafu. Intenzita 2 různých kanálů (nebo 3 různé kanály v tří-dimensnal pozemku) jsou reprezentovány podél různých OS. Události s podobnými intenzitami se budou sdružovat ve stejné oblasti na rozptylovém pozemku.

histogramy a bodové grafy poskytují různé výhody pro analýzu dat průtokové cytometrie. Výběr toho, jak nejlépe reprezentovat vaše data, může pomoci zajistit, aby vyprávěla kompletní příběh v jednoduchém, srozumitelném formátu.

Dot-grafy a histogramy se vzájemně nevylučují, a nejvíce komplexní průtoková cytometrie experimenty bude využívat více obrázků na displeji, bohaté, multi-parametrické údaje o vzorku.

v mnoha případech je třeba vykreslit více než tři parametry současně., V tomto případě, data-analýza techniky známé jako vtokové může pomoci dát další rozlišení a flexibilitu, umožňující analýzu téměř neomezené množství parametrů současně přes několik různých scatter-grafy a histogramy.

Gating přidává rozlišení dat průtokové cytometrie

stručně řečeno, gating je metoda pro výběr buněk z experimentu s průtokovou cytometrií, který chcete podrobněji analyzovat., Gating umožňuje výzkumníkovi shromažďovat a zobrazovat více informací o subpopulaci buněk, než by se normálně zobrazovalo na 2 – nebo 3-dimenzionálním dot-plot.

Gating přidává rozlišení do experimentu s průtokovou cytometrií a umožňuje simultánní analýzu téměř neomezeného počtu různých parametrů (kanálů).

V uzavřené Průtokové Cytometrie Experiment:

• uživatel shromažďuje průtoková cytometrie údajů z jednoho nebo více kanálů na dot-plot.
• na základě získaných dat Uživatel nakreslí gate box s výběrem subpopulace buněk pro další analýzu.,
• subpopulace buněk v bráně bude specificky zvýrazněna na jiných pozemcích zobrazujících informace z alternativních kanálů.

Brány přidat neuvěřitelné množství flexibilitu, průtoková cytometrie, poskytování až na jeden-mobilní řešení pro každý kanál k dispozici, aby výzkumník. Několik bran mohou být stanoveny pro jeden scatter-plot a brány může být „stohovat“ a kombinované (tj. subpopulace buněk bránou pro kanály 1 a 2 lze dále bránou pro kanály 3 a 4 umožňují větší specifičnost a hlubší analýzu).,

příklad gating

poznámky na Odškodnění

Přelévání z jednoho kanálu do jiného, může to způsobit falešně identifikovány jako pozitivní signály. Přelévání je artefaktuální signál, který může způsobit jedno fluorescenční barvivo v kanálu jiného fluoroforu jako funkci jeho relativního jasu a emisního spektra. To je místo, kde kompenzace přichází do hry. Kompenzace je postup, který izoluje signál z jednoho konkrétního kanálu od ostatních kanálů používaných ve stejném experimentu. FITC např., má svůj emisní vrchol v zeleném rozsahu elektromagnetického spektra. To však také fluoreskuje ve žlutém kanálu, kde PE vyzařuje světlo. Jednoduše řečeno, kompenzace odečte signál FITC z kanálu PE.

tento signál v“ nesprávném “ kanálu se odečte od signálu způsobeného fluoroforem zájmu. Ve výše uvedeném vzorku je poměr zelené a žluté složky při dané excitační vlnové délce konstantní pro FITC., Je tedy možné odvodit množství nespecifických žlutý signál FITC PE kanál z měření v zeleném kanálu pomocí konstantní vyrovnávací koeficienty. Totéž platí pro přeliv z PE do kanálu FITC.