elektroforéza DNA Gel je technika používaná k oddělení a identifikaci fragmentů DNA na základě velikosti.
fragmenty DNA různých velikostí jsou naloženy do porézního gelu vyrobeného z agarózy-uhlohydrátu nalezeného v červených řasách.
při aplikaci elektrického pole budou fragmenty migrovat přes gel díky negativně nabitým fosfátovým skupinám v nukleotidech DNA.
menší kusy DNA snadněji migrují přes gel než větší fragmenty, které mají obtížnější pohyb v gelové matrici.,
po dokončení běhu gelu lze umístění vzorků DNA porovnat s řadou fragmentů nebo pásem známých velikostí, nazývaných dna žebřík.
přítomnost vašeho fragment zájmu pak může být potvrzena na základě jeho velikosti, která je stanovena porovnáním relativní umístění zkušebního vzorku do fragmentů žebříku.
agarózové gely se připravují za použití hmotnostního procentního roztoku. Takže 1 gram agarózy ve 100 ml pufru vytvoří 1% gel., Nižší procento gelů lépe vyřeší větší fragmenty a vyšší procento gelů usnadní identifikaci menších fragmentů. Začít gelu-dělat postup, naváží příslušné množství agarózy do Erlenmeyerovy baňky.
přidejte do baňky běžící vyrovnávací paměť tak, aby objem vyrovnávací paměti nebyl větší než 1/3 kapacity baňky. Pak se víří, aby se promíchal.
roztavte směs agarosy/pufru zahříváním v mikrovlnné troubě při maximálním výkonu. Každých třicet sekund vyjměte baňku a otočte obsah, aby se dobře promíchal. Opakujte, dokud se agarosa úplně nerozpustí.,
Dále přidejte ethidiumbromid do koncentrace 0, 5 mg/ml. Ethidiumbromid je aromatická sloučenina, která zapadá mezi jednotlivé bázové páry DNA nebo interkaláty a způsobuje, že DNA emituje intenzivní oranžovou fluorescenci pod UV světlem. Je důležité si uvědomit, že ethidiumbromid je karcinogen, takže při manipulaci s gely obsahujícími tuto sloučeninu je třeba vždy nosit rukavice.
aby se zabránilo deformaci gelového zásobníku, nechte agarózu vychladnout umístěním do vodní lázně o teplotě 65 ° C.
Jako agarózového je chlazení, přípravu gelu plíseň umístěním gel zásobník do licí aparát., Jako alternativu můžete použít pásku k utěsnění otevřených okrajů zásobníku gelu k vytvoření formy. Umístění hřebenu do gelu vytváří studny, kde je načtena DNA. Ujistěte se, že hřeben vytvoří studnu, která je vhodnou velikostí pro vzorek DNA.
nalijte roztavenou agarózu do gelové formy a nechte ji ztuhnout při pokojové teplotě.
po ztuhnutí agarózy vyjměte hřeben. Pokud se gel nebude používat okamžitě, zabalte jej do plastového obalu a uchovávejte při 4 ° C až do použití.
Pokud se gel použije okamžitě, vložte jej do gelové krabice.,
Chcete-li zahájit tento postup, přidejte do vzorků DNA, které mají být odděleny, barvivo pro načítání gelu. Nakládací barvivo se obvykle vyrábí v koncentraci 6X. Nakládací barvivo pomáhá vizualizovat a načíst vzorky do jamek a pomáhá určit, jak daleko vzorky migrovaly během běhu.
nastavte napájecí zdroj na požadované napětí.
Nyní přidejte do gelové krabice dostatek běžícího pufru k pokrytí povrchu gelu. Ujistěte se, že používáte stejný běžící pufr jako ten, který se používá k přípravě gelu.
připojte vodiče gelové krabice k napájecímu zdroji a zapněte jej., Nezapomeňte, že DNA je negativně nabitá a bude se pohybovat směrem k anodě, která je pozitivní a obecně červená. Ujistěte se, že nepřipojujete černý vodič nebo katodu ke spodní části gelové krabice. Takže nezapomeňte, mějte na paměti, že černé kočky mají smůlu nebo negativní, a Černá katoda je proto negativní. Spusťte gel na červenou nebo anodu. Ověřit, zda funguje jak gelová skříň, tak napájecí zdroj; vzhled bublin na elektrodách naznačuje, že prochází proud.
sejměte víko gelové krabice., Pomalu a opatrně vložte vzorky DNA do gelu. Opět platí, že načítání barviva ve vzorku umožňuje vzorku ponořit se do gelu a pomůže sledovat, jak daleko vzorku cestoval. Značka velikosti DNA nebo žebřík by měla být vždy naložena spolu s experimentálními vzorky.
vyměňte víko. Zkontrolujte, zda jsou elektrody zapojeny do správných slotů v napájecím zdroji.
zapněte napájení. Spusťte gel, dokud se barvivo nepřesune do vhodné vzdálenosti.
po dokončení elektroforézy vypněte napájení a vyjměte víko gelové krabice.,
odstraňte gel z gelové krabice a vypusťte přebytečný pufr na povrchu gelu. Umístěte gelový zásobník na papírové ručníky, abyste absorbovali zbývající provozní vyrovnávací paměť.
Chcete-li vizualizovat fragmenty DNA, vyjměte gel z gelové misky a vystavte gel ultrafialovému světlu.
fragment DNA by se měl ukázat jako oranžové fluorescenční pásy. Vyfoťte gel.
na konci experimentu řádně zlikvidujte gel a provozní vyrovnávací paměť podle předpisů instituce. Znovu nezapomeňte vždy manipulovat s gelem a běžícími pufry rukavicemi, abyste zabránili expozici ethidiumbromidu.,
nyní, když jste viděli, jak provádět elektroforézu dna gelu. Podívejme se na některé následné aplikace a variace této velmi užitečné metody.
zde vidíte výsledek elektroforézy agarózového gelu po oddělení produktů PCR. Fragmenty DNA vložené do gelu jsou viditelné jako jasně definované pásy. Standard DNA nebo žebřík by měl být oddělen do stupně, který umožňuje užitečné stanovení velikostí vzorkových pásem. V tomto příkladu jsou na 1 odděleny fragmenty DNA 765 párů bází, 880 párů bází a 1022 párů bází.,5% agarózový gel s 2-log dna žebříkem.
kromě potvrzení přítomnosti fragmentu DNA, který je předmětem zájmu, lze elektroforézu dna gelu kombinovat s postupy čištění gelu. Typicky žiletka se používá vyříznout fragment DNA zájmu, tak, že to může být shromažďovány a DNA ve vzorku je zpět.,
Agarózového gelu electrophesis může také být kombinovány s převodem blotting, které zahrnuje, což DNA, nebo RNA, transfer na celulózové membráně, kde je radioaktivní sondy mohou být použity k identifikaci konkrétní DNA nebo RNA sekvence ve vašem electrophoretically oddělený vzorek.
standardní dna gelová elektroforéza není ideální pro oddělení DNA s vysokou molekulovou hmotností větší než 15-20 kb, jako je genomická DNA. Pro oddělení velkých vzorků DNA se používá elektroforéza pulzního pole, která zahrnuje vystavení gelu měnícímu se nebo pulzujícímu elektrickému poli v různých směrech., Tato technika zahrnuje specializované gelové běžící zařízení, které má páry elektrod uspořádaných v různých orientacích kolem gelu. To lze použít k detekci rozdílů ve velikostech genomu mezi populacemi organismů, jako jsou sdružené vzorky DNA z různých mikrobiálních komunit, vidíte zde, které jsou převzaty z různých prostředí jezera.
právě jste viděli úvod do elektroforézy dna gelu., Ukázali jsme vám koncept metody, jak připravit agarózový gel, jak načíst vzorky, jak spustit gel a analyzovat jej a některé běžné aplikace elektroforézy agarózového gelu. Díky za sledování a hodně štěstí s spuštěním gelu.