Hranic, v Celland Vývojové Biologie

Úvod

Tukové odvozené stromální buňky (ASCs) jsou multipotentních a immunoprivileged, což z nich dělá ideální kandidáty pro léčebné účely (Bourin et al., 2013; Ma et al., 2014; Kallmeyer and Pepper, 2015). Asc lze izolovat pomocí minimálně invazivních technik z různých DEP tukových tkání v těle (Zuk et al., 2001)., Vyznačují se schopností přilnout k plastu, jedinečným profilem povrchových markerů a schopností diferencovat se na kosti, tuk a chrupavku (Dominici et al., 2006; Bourin et al., 2013). Asc zahrnuje ~15-30% stromální vaskulární frakce (SVF) tukové tkáně (Bourin et al., 2013; Zuk, 2013) a je třeba ji rozšířit ex vivo, aby se získal dostatečný počet buněk pro terapeutické účely.,

Poskytování bezpečné a regulované produktů buněčné terapie pro pacienty vyžaduje dodržování správné výrobní praxe (GMP), a pokyny pro správnou výrobní praxi by měly být dodržovány v procesu izolace, rozšiřování a rozlišování ASCs (Giancola et al., 2012). Četné činidla používané k izolaci a rozšířit ASCs pro výzkumné účely jsou živočišného původu, nebo jsou z klinického stupně; proto tyto musí být nahrazeny vhodnější alternativy podle GMP standardů (Halmemu a Kessler, 2006; Riis et al., 2015)., Jsme recenzi volba sérum suplementace, která může být použita pro ASC expanze namísto fetální bovinní sérum (FBS), a popsat jejich účinky in vitro a in vivo, jak je uvedeno v literatuře.,

Mezinárodní Společnosti pro Buněčnou Terapii (ISCT) a Mezinárodní Tuku Použita Technologie Společnosti (IFATS) Zásady a Techniky Používané k Posouzení Tukové Odvozené Stromální Buňky Vlastnosti

stanovit minimální kritéria a pokyny byly doporučeny Mezinárodní Společnosti pro Buněčnou Terapii (ISCT) a Mezinárodní Tuku Použita Technologie Společnosti (IFATS) pro charakterizaci ASCs (Dominici et al., 2006; Bourin et al., 2013)., Tato kritéria zahrnují schopnost asc přilnout k plastu, jejich profil povrchového markeru a jejich potenciál diferenciace trilineage. Nejnovější příspěvek o poloze popisuje životaschopnost a proliferaci jako další měření původních kritérií charakterizace. Dále byly definovány experimentální metody a testy pro měření kritérií charakterizace (Bourin et al., 2013)., Ukázalo se, že tato kritéria jsou ovlivněna mnoha faktory, jako je liposukční technika, technika izolace SVF a média a suplementace používaná během procesu expanze (Koellensperger et al., 2014; Bajek et al., 2015; Busser et al., 2015). Podle ISCT a IFATS pokyny je doporučeno a přijato výzkumné praxe potvrdit dodržování výše uvedených pokynů pro každou izolaci a kultivaci stavu s cílem klasifikovat výsledná populace buněk jako ASCs.,

Techniky a Metody Používané k Charakterizaci ASCs

Morfologie a Dodržování

Jednou nasazený, přívrženec ASCs zobrazení odlišné morfologie, která může být popsán jako tenké, protáhlé a vřetenovité. Morfologické hodnocení asc je obvykle předformováno pomocí světelné mikroskopie (Trojahn Kølle et al., 2013).

Šíření

ISCT a IFATS pokyny doporučují, že šíření a frekvence předek ACSs se měří fibroblastoidní kolonie tvořící jednotky test (Bourin et al., 2013)., Jiné techniky používané ve studiích citovaných v tomto přehledu využívají počítání životaschopných buněk nebo měření proliferační kapacity asc pomocí imunohistochemie. Počítání metody zahrnují (1) počítání buněk pomocí životaschopnost barviva a hemocytometer, (2) počítání buněk pomocí buď počítání korálků nebo techniky barvení a průtokovou cytometrii analýzy, a (3) pomocí kolorimetrické testy, které měří životaschopných buněk na spektrofotometru (Gharibi a Hughes, 2012; Trojahn Kølle et al., 2013; Bogdanova et al., 2014; Atashi et al., 2015; Johal et al., 2015; Oikonomopoulos et al., 2015).,

Imunofenotypu

ISCT a IFATS pokyny uvedené exprese několika povrchových markerů, a jejich očekávaný procentuální hodnoty jako pevný požadavek na jejich místě prohlášení. Rovněž doporučili, aby exprese povrchových markerů byla měřena vícebarevným barvením protilátek (Bourin et al., 2013). Studie v tomto přehledu využily průtokovou cytometrickou analýzu k měření exprese povrchových markerů (Müller et al., 2006; Lindroos et al., 2009; Chieregato et al., 2011; Josh et al., 2012; Trojahn Kølle et al., 2013; Bogdanova et al., 2014; Patrikoski et al., 2014).,

Trilineage Diferenciace

Diferenciace do tukové, kostní a chrupavky se tradičně měří pomocí histochemického barvení techniky vizualizovat pod mikroskopem; nicméně, ISCT a IFATS pokyny doporučují, že kvalitativní hodnocení by měla být nahrazena nebo doplněna kvantitativní přístupy, jako je měření lineage specifické expresi mRNA pomocí reverzní transkripce kvantitativní polymerázové řetězové reakce (RT-qPCR) techniky (Bourin et al., 2013)., Techniky, které byly použity pro měření diferenciace kapacity, popsal ve studiích citovaných v této recenzi, se lišily od histochemické barvení, konvenční PCR a RT-qPCR. Histochemické barvení techniky patří barvení buněk, buď (1) oil red O a nile red pro adipogenesis; (2) Alizarinové červeně S, alkalické fosfatázy a von Kossa pro osteogenesis; nebo (3) Alcian blue a safranin pro chondrogenesis (Müller et al., 2006; Kocaoemer et al., 2007; Hebert et al., 2010; Rajala et al., 2010; Koellensperger et al., 2014; Oikonomopoulos et al., 2015; Riis et al., 2016).,

suplementace séra

fetální bovinní sérum

FBS je tradiční sérový doplněk používaný pro buněčnou kulturu. FBS obsahuje růstové faktory (GFs) a další prvky nezbytné pro ASC upevnění, rozšíření, údržba a proliferaci in vitro (Lennon et al., 1995, 1996; Zuk et al., 2001; van der Valk et al., 2010). FBS je náchylná k dávkové variaci, xenoimunizaci a možné kontaminaci mykoplazmou, viry, endotoxiny a priony (van der Valk et al., 2004, 2010; Chieregato et al., 2011; Kyllonen et al., 2013; Jin et al., 2015)., Zdroj a kvalita FBS může ovlivnit proliferaci a diferenciaci asc a rutinní screening mykoplazmy, endotoxinů a virů se stal důležitým (Naaijkens et al., 2012). Tyto faktory mohou ovlivnit experimentální výsledky a učinit buněčný produkt nebezpečným pro klinické použití (Zuk et al., 2001; van der Valk et al., 2004; Witzeneder et al., 2013).

ASCs jsou immunoprivileged, chybí vyjádření hlavní histokompatibilní komplex II. třídy, stejně jako T a B buněk, kostimulační molekuly (CD80, CD86 a CD40)., In vitro imunogenita a imunosupresivní vlastnosti ASCs jsou obvykle měří co-kultivaci ASCs s periferní krevní mononukleární buňky ve smíšené lymfocytární reakce a měření T-cell proliferative response (McIntosh et al., 2006; Patrikoski et al., 2014). ASCs prokázat, imunomodulační a imunosupresivní vlastnosti, o čemž svědčí jejich schopnost regulovat funkce T-buněk a modulovat sekrece cytokinů in vitro a in vivo (Leto Barone et al., 2013; Roemeling-van Rhijn et al., 2013; Patrikoski et al., 2014)., Tyto vlastnosti vyplývají z nízké imunogenity asc. Většina ASC a dalších mezenchymálních kmenových buněk (MSC) klinická hodnocení (fáze I, II, a III) použití FBS doplněny média, a to bylo hlásil, že imunogenní účinky jsou vyvolané komponenty FBS u lidských subjektů (Sundin et al., 2007; Riis et al., 2015). Například klinická studie s použitím MSCs odvozených od kostní dřeně (BM-MSc) rozšířená v FBS našla protilátky proti složkám FBS (Horwitz et al., 2002)., V klinických studiích, kde byli pacienti léčeni dendritickými buňkami a lymfocyty vystavenými FBS (Selvaggi et al., 1997; Mackensen et al., 2000). V kontrastu, meta-analýza MSC klinických studiích zjištěno, že více než 75% pokusů používá FBS v jejich expanzi buněk protokoly a pouze jedna studie sledovány a prokázány nežádoucí účinky na FBS (Lalu et al., 2012)., Studie in vivo zkoumající imunitní odpověď myší na asc ukázaly zachovanou imunosupresi a imunomodulaci, nízkou imunogenitu a žádnou reakci na FBS (Cho et al., 2009; González et al., 2009). Ačkoli asc jsou rozsáhle testovány v klinických studiích, jejich definitivní použití jako terapeutické činidlo musí být stanoveno. To je dále umocněno použitím předklinických modelů, které nemusí být biologicky relevantní (Monsarrat et al., 2016). FBS může být navíc méně imunogenní u myší a jiných zvířecích modelů než u lidí., Nakonec imunitní odpověď vyvolaná FBS (Selvaggi et al., 1997; Mackensen et al., 2000; Horwitz et al., 2002) by mohl teoreticky ovlivnit odmítnutí transplantovaných buněk v buněčné terapii.

alternativy bez séra

neznámé a nedefinované složení FBS je hlavní nevýhodou. Vhodnější alternativou by být chemicky definované médium se známým složením, jako jsou komerčně dostupné serum-free (SF), nebo XF média (Usta et al., 2014)., Tato média bez séra se mylně domnívají, že neobsahují žádné živočišné produkty, protože termíny SF a XF se často používají zaměnitelně. Média SF jsou však obvykle doplněna zvířecím nebo lidským sérovým albuminem a GFs v nedefinovaných množstvích (Patrikoski et al., 2013). Na druhé straně jsou média bez xenonů chemicky definovaná média obsahující dobře definované složky ve specifických koncentracích (Usta et al., 2014).

růstové faktory

další alternativou k séru je přidání GFs do kultivačního média, buď izolovaně, nebo jako koktejl., Tyto GFs mohou být syntetické, odvozené od zvířat nebo odvozené od člověka. Nahrazení syntetickými GFs je výhodné díky jejich vyšší kvalitě a v důsledku standardizace mezi šaržemi, což nemusí být možné pro GFs odvozené od zvířat nebo lidí. Běžně používané GFs jsou růstový faktor fibroblastu, epidermální růstový faktor a růstový faktor odvozený od destiček (PDGF; Baer a Geiger, 2012; Ahearne et al., 2014). Přidání GFs bylo spojeno se zvýšením proliferace (Hebert et al., 2010; Gharibi a Hughes, 2012)., Zlepšený adipogenní diferenciační potenciál byl dříve hlášen v asc rozšířeném v GF doplněném médiu (Hebert et al., 2010). Další studie však pozorovala negativní vliv na adipogenní a osteogenní diferenciaci u dlouhodobě kultivovaných asc (Gharibi a Hughes, 2012).

sérový Albumin

sérový albumin je bohatý plazmatický protein a může být izolován od lidí a zvířat. Často jsou média SF doplněna sérovým albuminem., Studie porovnávající lidský sérový albumin pro ASC média doplnění našli lepší proliferace, menší vřeteno-jako morfologie a zachována diferenciace do tukové, kostí a chrupavek (Rajala et al., 2010; Johal et al., 2015).

Chemicky Definované XF Střední

Xeno-free médiu byla doporučena jako náhrada za FBS a sérum, protože obsahuje potřebné komponenty pro ASC expanze, nezahrnuje dárce nebo batch-to-batch variability, je GMP vyhovující a má minimální imunogenicitu a příznivé imunosuprese (van der Valk et al., 2004, 2010; Usta et al.,, 2014). Ve srovnání s FBS vedlo použití XF média pro expanzi asc k lepší morfologické kvalitě, zvýšené proliferaci, srovnatelnému imunofenotypu a diferenciaci na tuk, kost a chrupavku (Lindroos et al., 2009; Patrikoski et al., 2013; Oikonomopoulos et al., 2015). Použití médií XF v expanzi ASC vede k tomu, že asc ztrácí schopnost přilnout k plastu (Kyllonen et al., 2013; Patrikoski et al., 2013; Oikonomopoulos et al., 2015). K udržení vlastní charakteristiky plastické adherence spojené s ASC jsou zapotřebí další nátěrové hmoty., Komerčně dostupné médium XF je drahé a příprava interního média XF může být časově náročná a může zvýšit riziko variace šarží a šarží (Lund et al., 2009; Baer et al., 2010; Rajala et al., 2010; Yang et al., 2012; Kyllonen et al., 2013; Patrikoski et al., 2013; Oikonomopoulos et al., 2015).

Lidské Alternativy

Lidské alternativy mohou nahradit FBS a SF/XF doplněny média a může vytvořit kulturu prostředí, které přesněji podobá lidské prostředí (Azouna et al., 2012; Koellensperger et al., 2014)., Kromě toho použití autologních přípravků (odvozených od stejného jedince) eliminuje potřebu testování infekčních a jiných původců onemocnění.

Lidské Sérum

Po celé krve bylo povoleno sraženiny v absenci antikoagulační a byla centrifugována, sérum je výsledná kapalina část, která neobsahuje krevní destičky, bílé krvinky nebo červené krvinky (Obrázek 1; Stedman, 2006). Lidské sérum (HS) může být buď autologní (dárce a příjemce jsou stejní jedinci) nebo alogenní (odvozené od jedinců, kteří se liší od příjemce)., Autologní i alogenní HS jsou lepší než FBS (Stute et al., 2004; Bieback et al., 2009, 2012; Bernardo et al., 2011; Kyllonen et al., 2013; Patrikoski et al., 2013). ASCs rozšířen v HS mají větší transcriptome stability, než ty, rozšířen v FBS, vzhledem k tomu, že geny odpovědné za prodloužení buněčného cyklu, diferenciace a extracelulární matrix a inhibuje syntézu prostaglandinů jsou upregulovány a nadměrně exprimován v FBS, když ve srovnání s HS pomocí microarray analýzy (Shahdadfar et al., 2005)., ASCs rozšířen v FBS dosáhl stárnutí dříve a zobrazí zkrácení telomery oproti ASCs rozšířen v HS (Shahdadfar et al., 2005). Zdá se, že výběr HS má malý vliv na imunomodulační vlastnosti asc. Asc rozšířena buď alogenní HS nebo FBS obsahující média měla nízkou imunogenitu a vyústila v imunosupresi (Patrikoski et al., 2014). Asc rozšířen buď autologní nebo alogenní HS vykazují větší proliferaci a nerozeznatelný imunofenotyp ve srovnání s ASC rozšířen v FBS(Josh et al ., 2012; Bogdanova et al., 2014)., ASCs rozšířen v alogenní HS byly rozlišeny do tukové, kosti a chrupavky, i když upregulace chondrogenic a osteogenních genů byl favorizován oproti FBS (Joshi et al., 2012). Asc rozšířený v autologních HS byl diferencován na tuk a chrupavku; schopnost diferenciace na kost však byla méně zvýhodněná (Bogdanova et al., 2014). Autologní HS může poskytnout asc s lepší proliferací a genomickou stabilitou, jak je stanoveno analýzou mikroarray ve srovnání s alogenní HS (Shahdadfar et al., 2005; Bieback et al., 2009; Bernardo et al., 2011)., Asc rozšířen v alogenní HS vstoupil do zástavy růstu a podstoupil buněčnou smrt (Shahdadfar et al., 2005; Lindroos et al., 2009), který omezuje potenciální výhody alogenní HS. Při autologní HS může být ideální, jeho dostupnost je omezená a mohou být významné rozdíly mezi pacienty ve schopnosti jejich vlastní sérum na podporu růstu jejich vlastních buněk (Lange et al., 2007). Alternativně lze alogenní HS spojit, čímž získáte větší množství pro laboratorní experimentování a můžete podstoupit přísné testování kvality krevní bankou (např.,, testování na nepřítomnost infekčních agens a kontaminaci jinými krevními buňkami) před použitím u lidí (Bieback et al., 2009).