SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfát-polyakrylamidovém gelu elektroforéza) je běžně používané v laboratoři pro separaci proteinů na základě jejich molekulové hmotnosti. Je to jedna z těch technik, která se běžně používá, ale není často plně pochopena. Tak to zkusíme napravit.
SDS-PAGE separuje proteiny podle jejich molekulové hmotnosti, na základě jejich rozdílných sazeb migrace přes prosévání matrix (gel), pod vlivem aplikovaného elektrického pole.,
Takže Rychlost Bílkovin Migrace Úměrná Molekulové Hmotnosti
pohyb nabité druhů prostřednictvím elektrického pole je dána jeho náboj, jeho molekulární poloměr a velikost aplikované oblasti. Ale problém s nativně složené bílkoviny je, že ani náboj, ani jejich molekulární poloměr je molekulární hmotnosti závislé. Místo toho je jejich čistý náboj určen složením aminokyselin, tj. součtem pozitivních a negativních aminokyselin v proteinu a molekulárním poloměru terciární strukturou proteinu.,
v jejich rodném státě, a různé proteiny se stejnou molekulární hmotnost by migrovat různou rychlostí v elektrickém poli v závislosti na jejich starosti a 3D tvar.
K oddělení proteinů v elektrickém poli na základě jejich molekulární hmotnosti, musíme zničit terciární struktury prostřednictvím snížení bílkovin pro lineární molekulu, a nějak maskovat vlastní náboj proteinu. Tam přichází SDS.,
Role SDS (et al)
SDS je detergent, který je přítomen v SDS-PAGE sample buffer, kde, spolu s trochou vroucí, a redukční činidlo (obvykle dvb-t nebo B-MI štěpí bílkoviny-protein seleničitého dluhopisy), to narušuje terciární struktury proteinů. To přináší složené proteiny dolů na lineární molekuly.
SDS také obaluje protein jednotným negativním nábojem, který maskuje vnitřní náboje na R-skupinách. SDS se poměrně rovnoměrně váže na lineární proteiny (kolem 1.,4G SDS/ 1g protein), což znamená, že náboj proteinu je nyní přibližně úměrný jeho molekulové hmotnosti.
SDS je také přítomen v gelu se ujistit, že jakmile jsou proteiny linearizovaný a jejich poplatky maskované, že to tak zůstane po spuštění.
dominantním faktorem při určování proteinu potaženého SDS je jeho molekulární poloměr., SDS-coated proteiny se ukázaly být lineární molekuly, 18 Nm široký a délka je úměrná jejich molekulární hmotnosti, tak molekulární poloměr (a tedy jejich pohyblivost v gelu) je určena molekulová hmotnost proteinu. Protože SDS-coated proteiny mají stejný náboj na hmotnostní poměr, tam bude žádná diferenciální migrace založené na starosti.
gelová matrice
v aplikovaném elektrickém poli se proteiny ošetřené SDS nyní pohybují směrem k pozitivní anodě různými rychlostmi v závislosti na jejich molekulové hmotnosti., Tyto různé mobility budou přehnané kvůli prostředí s vysokým třením gelové matrice.
Jak už název napovídá, gel matrix použity pro SDS-PAGE polyakrylamidovém, což je dobrá volba, protože to je chemicky inertní a především, mohou snadno být vyrobeny v různých koncentracích na produkci různých velikostí pórů dává řadu oddělující podmínky, které mohou být změněny v závislosti na vašich potřebách. Možná si pamatujete, že jsem předtím napsal článek o mechanismu polymerace akrylamidu.,
diskontinuální vyrovnávací systém a stohovací Gel-lemující je na startovní čáře
pro vedení proudu od katody (negativní) k anodě (pozitivní) přes gel je zjevně zapotřebí pufr. Většinou používáme diskontinuální vyrovnávací systém Laemmli. „Diskontinuální“ jednoduše znamená, že pufr v gelu a nádrži je jiný.
systém je obvykle nastaven pomocí stohovacího gelu při pH 6.8, pufrovaného Tris-HCl, běžícího gelu pufrovaného na pH 8.8 Tris-HCl a pufru elektrody při pH 8.3., Stohovací gel má nízkou koncentraci akrylamidu a běžící gel vyšší koncentraci schopnou zpomalovat pohyb proteinů.
Takže co jsou všechny ty různé pH?
No, glycin, mohou existovat tři různé stavy nabití, pozitivní, neutrální nebo negativní, v závislosti na pH. To je znázorněno na obrázku níže. Kontrola stavu náboje glycinu různými pufry je klíčem k celé stohovací gelové věci.,
takže takto funguje stohovací gel. Když je napájení zapnuto, záporně nabité glycinové ionty v pufru pH 8,3 elektrody jsou nuceny vstoupit do stohovacího gelu, kde je pH 6,8. V tomto prostředí se glycin přepíná převážně do stavu zwitterionic (neutrálně nabitého). Tato ztráta náboje způsobuje, že se v elektrickém poli pohybují velmi pomalu.
Cl – ionty (od Tris-HCl) na druhé straně se pohybují mnohem rychleji v elektrickém poli a tvoří iontovou frontu, která migruje před glycinem., Separace Cl – z Tris counter-ion (která se nyní pohybuje směrem k anodě) vytváří úzké zóny s strmý gradient napětí, který táhne glycin spolu za to, což vede ve dvou úzce oddělených frontách migraci iontů; vysoce mobilní Cl – přední, následuje pomalejší, většinou neutrální glycin přední.,
Všechny proteiny v gelu vzorku elektroforetická pohyblivost, která je přechodný mezi extrémní mobility glycin a Cl-, takže když na dvou frontách zamést přes vzorek dobře, bílkoviny jsou soustředěny do úzkého pásma mezi Cl – a glycin frontách.
a jsou pryč!
tento průvod pokračuje, dokud nenarazí na běžící gel, kde se pH přepne na 8.8. Při tomto pH jsou molekuly glycinu většinou negativně nabité a mohou migrovat mnohem rychleji než proteiny., Takže glycinová fronta zrychluje kolem bílkovin a zanechává je v prachu.
výsledkem je, že proteiny jsou dumpingové ve velmi úzkém pásmu na rozhraní pro stohování a běží gely a protože běží gel má zvýšené koncentrace akrylamidu, který zpomaluje pohyb proteinů v závislosti na jejich velikosti, oddělení začíná.
o čem to všechno bylo?
Pokud stále přemýšlíte, proč je potřeba stohovací gel, přemýšlejte o tom, co by se stalo, kdybyste ho nepoužívali.,
gelové jamky jsou hluboké kolem 1 cm a obvykle je musíte podstatně naplnit, abyste získali dostatek bílkovin na gel. Takže při absenci stohovacího gelu by váš vzorek seděl na vrcholu běžícího gelu, jako pásmo až 1 cm hluboké.
Spíše než se seřadili dohromady a bít běží gel spolu, to by znamenalo, že proteiny ve vašem vzorku by se to všechno zadejte systémem gel v různých časech, což vede k velmi rozmazaný pruhy.,
takže stohovací gel zajišťuje, že všechny proteiny dorazí do běžícího gelu současně, takže proteiny stejné molekulové hmotnosti migrují jako těsné pásy.
Oddělení
Jakmile jsou proteiny v běhu gel, jsou odděleny, protože vyšší molekulové hmotnosti proteinů, více se pohybovat pomalu přes porézní gel akrylamid než nižší molekulové hmotnosti proteinů. Velikost pórů v gelu může být změněna v závislosti na velikosti proteinů, které chcete oddělit změnou koncentrace akrylamidu. Typické hodnoty jsou uvedeny níže.,
Pro širší separace rozsahu, nebo pro bílkoviny, které jsou těžko oddělit, gradient gel, který má vrstvy zvyšuje koncentrace akrylamidu, mohou být použity.