plicní hodnocení. Testy plicní funkce (PFT) byly provedeny pomocí spirometru Brentwood v naší kanceláři. Někteří pacienti podstoupili testování jinde.
imunitní testování. Testy byly provedeny v laboratořích Immunosciences pod vedením a. Wojdaniho, Ph.D.. Vzhledem k významu těchto testů v souvislosti s tímto hodnocením je metodika podrobně popsána.,
Příprava formaldehyd-lidský sérový albumin (F-HSA) a Formaldehyd-bovinní sérový albumin (F-BSA) konjugáty:
Elektroforetické a immunoelectrophoretic srovnání HSA, BSA S F-HSA a F-BSA byla provedena k určení, časování výskytu. Konjugace byla prokázána změněnou pohyblivostí F-HSA, F-BSA, když byla porovnána s HSA nebo BSA. Navíc, počet volných aminokyselin přidat skupiny přítomné v F-HSA nebo F-BSA byla stanovena metodou Snyder a Sobocinski (1975) a byl použit k posouzení výše náhrady., Počet aminoskupin vázaných na formaldehyd byl 26 pro HSA a 31 pro BSA. V tomto výpočtu byla zvažována tvorba intermolekulárního zesítění.
Příprava toluen diisokyanát-lidský sérový albumin (TDI-HSA) a Bovinní sérový albumin (TDI-BSA) konjugáty:
Tato příprava byla podobná metody Dewar a Baur (1982). Podle této metody, 1g HSA nebo BSA 1g se rozpustí v 100 ml tlumivý roztok obsahující chlorid draselný (0.05 mol/l), dekahydrát tetraboritanu sodného (0.05 mol/l), PH 9.4 a ochladí na 4 ° C. v Dioxanu (10 ml) obsahující 0.,15 ml toluen diisokyanát byl pak přidán po kapkách za stálého míchání po dobu 3 hodin, následným přídavkem 2 ml ethanolaminu, centrifugace, dialýza, filtrace a lyofilizace. Podobně jako u F-HSA a F-BSA byla konjugace potvrzena elektroforézou a určením volných aminoskupin přítomných v konjugátu. Počet aminoskupin vázaných na TDI byl 37 pro HSA a 43 pro BSA. Kromě toho byla spektrografická analýza konjugátu provedena podle Zeiss et. Ala. (1980)., Došlo k výraznému zvýšení absorpce z 230 na 260 nm, což naznačovalo, že TDI se stal kovalentně spojen s proteinovým nosičem. Toto zvýšení absorpce souhlasila s NH2 skupinou stanovení pouze 76% pro HSA a 81% pro BSA
Příprava trimelitová anhydrid-lidský sérový albumin (TMA-HSA) a Trimelitová anhydrid bovinní sérový albumin (TMA-BSA):
připravit tyto konjugáty 25 mg. z TMA se rozpustí v 0,5 ml dioxanu a přidá se po kapkách buď do 25 mg HSA nebo BSA rozpuštěného v 5 ml studené 7% NaHCO3 ve vodě., Po míchání po dobu 60 minut při 4 C byly konjugáty dialyzovány proti čtyřem změnám 0,1 M NaHCO3 a jedné změně pufru. Nakonec byly konjugáty filtrovány a udržovány na -20 C, dokud nebyly použity. Byly provedeny analýzy od TMA-HSA a TMA-BSA za účelem stanovení počtu zbytků TMA spojených s odpovídajícím nosným proteinem. Koncentrace nosného proteinu byla přeměněna na molární koncentraci s molekulovou hmotností HSA a BSA. Z poměru molární koncentrace TMA ligandu a proteinového nosiče byl vypočítán poměr zbytků TMA na molekuly nosiče., Odhaduje se, že TMA-HSA obsahuje 5 zbytků TMA na molekuly HSA a pro TMA-BSA sedm reziduí na molekulu albuminu (Pien et al., 1988).
Příprava ftalanhydridu-lidský sérový albumin (PA-HSA) a ftalanhydridu bovinní sérový albumin (PA-BSA) konjugáty:
Tyto hapten-konjugáty byly připraveny přidáním 75 mg PA, aby ochlazený roztok v dávce 300 mg HSA nebo BSA ve 100 ml H2O. Reakční směs byla míchána přes noc, dialyzed proti 0,1 M PBS pomocí trubky s cutoff 8000 dalton. Použití metody Zeiss et. Ala. (1977) byly vypočteny molární poměry., Bylo zjištěno, že molární poměry jsou 22/28 pro PA / HSA a 25/30 pro PA / BSA.
Příprava konjugátů benzenového kruhu HSA (B-HSA) a benzenového kruhu BSA (B-BSA):
pro tyto přípravky 40 mg. kyseliny p-aminobenzoové se rozpustí ve 2 ml 1 N HCL a ochladí se ponořením do ledové lázně. Po kapkách byl přidán studený roztok 14 mg / ml. Po každém přidání se směs míchá po dobu 30 sekund. Souběžně byl jeden gram HSA nebo BSA rozpuštěn v kyselině borité 0,16 m chloridu sodného (0-15 M) pufru PH 9,0 (PH bylo zvýšeno NaOH)., Kádinky obsahující roztoky albuminů byly obklopeny ledovou lázní na magnetickém míchadle. Roztok diazoniové soli byl přidán po kapkách za rychlého míchání do roztoku studeného proteinu. Po přidání každé kapky je PH upraveno na 9,0 až 9,5 s jedním normálním NaOH. Když byl přidán celý roztok, reakce mohla pokračovat s pomalým mícháním po dobu nejméně jedné hodiny s dalšími přírůstky roztoku NaOH a udržováním PH v rozmezí 9,0 až 9,5., Nezreagované malé molekuly byly odstraněny rozsáhlé dialýzu nebo průchodem přes kolonu sephadex G-25 v chladné místnosti, s izotonickým solným roztokem jako elučního pufru. Byly provedeny analýzy oranžové barvy vývoje B-HSA a B-BSA za účelem stanovení počtu reziduí B spojených s odpovídajícím nosným proteinem. Množství substituce B pro HSA bylo přibližně 41 A pro BSA 53 (Migrdichian, 1957).
Stanovení Protilátek proti:
Specifické protilátky proti F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA a B-HSA byly analyzovány pomocí nesoutěžní ELISA testu., Jamky mikrotitrační destičky (Dynatech, Alexandria, VA) byly potažené 100 1 antigen řešení (100 g/ml) v 0,1 M PBS PH 7,2 přes noc při 4 ° C. Destičky byly promyty 4 krát s 0,1 M PBS obsahujícím 0.05% tween 20 mezi každým krokem. Volná místa absorpce byla blokována 2% proteázovým proteázovým sérovým albuminem při pokojové teplotě po dobu 4 hodin a skladována při teplotě -20 ° C až do použití.,
Analytické Postup:
tento postup zahrnuje následující: (1) mytí čtyřikrát, (2) přírůstek 100 1 zředěného séra (1:2 pro IgE a 1:100 pro IgM a IgG) v PBS tween-20, 1% BSA (3) inkubace 4 hodiny při 20 C, následuje mytí 4 krát, (4) kromě 100 1 optimální ředění alkalické fosfatázy označené afinitně čištěné kozí anti-lidské IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) a anti IgG (1:1000), zakoupené z KPI (Maryland) (5) inkubační dobu 120 minut při teplotě 20 ° C, (6) praní 6 krát, (7) přidání 100 1 P-nitrofenyl fosfát (Sigma Chemical Co.,) (8) inkubace po dobu 60 minut při 20 C (9) přidání 50 1 roztoku hydroxidu sodného 3 N A (10) duplicitní čtení. Výsledky byly vypočteny na základě absorbancí duplicitních vzorků 405 nm pomocí mikrotitorové čtečky. Všechny vzorky byly odečteny proti antigenu HSA jako kontrola vazby nespecifické na F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA a B-HSA. Výsledky byly vyjádřeny jako titr. Titr je poslední ředění séra dávat absorbance dvakrát HSA kontroly.,
specificita a zkřížené inhibiční studie:
pro stanovení specificity protilátek byla provedena křížová inhibiční studie. Pozitivní séra pro každý hapten-proteinový konjugát byla spuštěna po vhodné inkubaci a srážení s desetinásobným zvýšením přírůstků HSA nebo BSA vázaných na hapten jako inhibitory k pokrytí rozsahu protilátek proti nadbytku antigenu. Tento rozsah byl mezi 50 g až 1000 g pro hapten-BSA a 80 g až 1000 g pro hapten-RSA., Po inkubaci při 37 ° C a odstranění precipitátu centrifugací a vzorky z před a po cross-studie inhibice pak byly umístěny na deskách s wells potažené konkrétní konjugát. Následující kroky byly dodrženy, jak je popsáno výše pro studii ELISA.
vazba IgG a IgM protilátek na různé konjugáty byla inhibována hapten-HSA nebo hapten-BSA z 36-85%. Při dané koncentraci jak hapten-HSA, tak hapten-BSA inhibovaly hladinu protilátek podobným způsobem.,
částečná inhibice vazby IgE protilátek na různé haptenové konjugáty byla pozorována, když bylo sérum předem inkubováno s hapten-HSA nebo hapten-BSA. Toto neúplné pozorování inhibice IgE protilátky souviselo hlavně s nedostupností séra s vysokými IgE titry proti různým chemikáliím v naší laboratoři.,
Stanovení Normální Hladiny Protilátek (Ovládání):
na Základě výše uvedených postupů, 160 dárců krve vzorky zdravých jedinců obou pohlaví, ve věku 22 až 55, byli vyšetřeny hladiny protilátek proti F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA, a B-HSA. Průměrný titr byl 1: 800 400 pro IgG, 1:3200 1600 pro IgM a 1:8 4 pro IgE. V naší laboratoři jsou tedy titry větší než 1:1600 pro IgG, 1:6400 pro IgM a 1:16 pro IgE považovány za pozitivní.,
u daného pacienta bylo zvýšení nebo pokles titrů protilátek o více než jedno ředění považováno za významné (viz tabulky).
podmnožina lymfocytů:
jeden laserový průtokový cytometr (epický profil: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL), který rozlišuje rozptyl světla vpřed a pravý úhel, stejně jako dvě barvy, byl použit se softwarovým balíčkem (Quad Stat: Coulter). Populace mononukleárních buněk byly stanoveny dvoubarevnou přímou imunofluorescencí pomocí techniky barvení celé krve s příslušnou monoklonální protilátkou a průtokovou cytometrií (Fletcher et al.,, 1989) následující dvojici fluorescein isothiokyanátem (FITC), nebo fykoerytrinem (PE)-konjugované monoklonální protilátky (Coulter imunologie) byly vybrány: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI a T11-FITC/Tal-PE pro stanovení T-cell/B-buňky, T-helper/T-tlumič, NKHT3+ /NKHY3 a pro alternativní cesta aktivace lymfocytů, resp.
pro sledování markerů lymfocytů byly Bat mapy nastaveny na populaci lymfocytů rozptylu světla vpřed v úhlu proti histogramu 90 světelného rozptylu., Procento pozitivně obarvených buněk pro každý marker dvojice, stejně jako procento dvojitě barvených buněk byla stanovena. Odhady absolutní počet lymfocytů pozitivní na příslušných povrchových markerů byly stanoveny vynásobením periferních lymfocytů buněk tím, že procento pozitivně obarvených buněk pro každý marker pár. Také bylo stanoveno procento dvojnásobně zbarvených buněk., Odhady absolutního počtu lymfocytů pozitivních pro příslušné povrchové markery byly stanoveny vynásobením počtu periferních lymfocytů procentem pozitivních buněk pro každý povrchový marker.
měření Anti-myelinových základních proteinových protilátek:
lidský myelinový základní protein (HMBP) byl připraven metodou Diebler et al. (1972) a zkontrolována čistota elektroforézou polyakrylaminového gelu. Antiserum na HMBP byl indukován u králíků opakovanou injekcí HMBP v úplném Freundově adjuvans., Protilátková aktivita u králíka séra a pacientovy vzorky byla zjištěna přidáním různých ředění (1:100 až 1:10 000) sér do jamek mikrotitrační destička dříve natírané s HMBP takto: HMBP 250 g/ml bylo rozpuštěno v karbonátovém pufru, PH 9.6 a 200 l tohoto roztoku bylo přidáno do každé jamky. Po inkubaci, promytí a blokování jak je uvedeno výše, bylo do jamek přidáno 200 1 zředěného králíka nebo lidského séra. Po inkubaci po dobu i hodiny při 37 C byly séra vytřepány ze studní a poté byly 5krát promyty promývacím roztokem., 200 1 z peroxidázy konjugované koza Anti-králík nebo koza anti lidské IgG, IgM nebo IgA (optimální ředění) byly přidány do příslušné studny. Po inkubaci a opakovaném praní bylo do každé jamky přidáno 200 1 substrátu ABTS. Destičky byly inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti a číst v mikrotitrační čtenáře na 405 tun vlnové délce. Použití králičí antiséra; titrační křivka byla vynesena a pacientova séra byla porovnána s touto standardní křivkou., Na základě více než 200 kontrol a stanovení vzorků pacientů byly litry větší než 1:2000 pro IgA, 1:5000 Pro IgM a 1:8000 pro IgG považovány za pozitivní.