Specifičnost a Účinnost Uracil DNA glykosylázou a tím Zprostředkovaný Pramen Štěpení Dotazovaných na Velké Pořadí Knihoven

UDG-zprostředkované uracil excize a chemické AP stránky štěpení na microarrays

vlákno DNA štěpení zprostředkované UDG se skládá ze dvou samostatných kroků: excize uracil základní následuje štěpení výsledných základním stránky. Tyto dva kroky lze samostatně sledovat na MIKROARRAYSECH DNA., Prvním, základním stránky jsou generovány působením pole s UDG a ve druhém kroku, pramen štěpení je indukována vystavením povrchu-upoutané, DNA oligonukleotidy obsahující základním stránky a to buď kyselé nebo základní podmínky, nebo odpařením povrchu do sucha. Tyto chemické strategií štěpit základním míst na DNA odstranit potřebu pro další enzymatické štěpení a umožňují UDG kinetika být studovány nezávisle na sobě., Pro tento účel, pole 30mer sekvence DNA, s rostoucí počet non-po sobě jdoucích dU-incorporations (dU1 – dU9) byly navrženy a syntetizovány maskless nukleové kyseliny fotolitografii, pomocí odpovídající fotosenzitivní dU phosphoramidite (Obr. 2). Každý řetězec DNA byl syntetizován s DT15-linkerem na skleněný povrch a ukončen na 5 ‚ – konci s 25mer cílovou sekvencí pro hybridizaci (QC25), jak je uvedeno na obr. 3.,

umístění všech sonda sekvence spolu s odpovídající opakování a kontrolu prameny nesoucí dT místo dU nukleotidů byla randomizovaná přes microarray povrchu., Před enzymatickým zpracováním byly sekvence DNA sondy hybridizovány na komplementární oligonukleotid označený Cy3 (QC25c) za účelem stanovení počátečních hodnot intenzity fluorescence. Označení 3 ‚ – Cy3 bylo použito k prevenci možných fluorescenčních artefaktů v důsledku interakcí barviva s proměnným počtem dUs46. Na microarrays pak byly vystaveny komerčně-source UDG z E. coli a základním stránky štěpení byla následně provedena za různých podmínek. Optimální doba expozice enzymu byla stanovena v počátečních experimentech. Naše výsledky (obr., S1) ukazují, že po přidání enzymu štěpení účinnost se zvyšuje výrazně s časem, a to až do jedné hodiny, dosahuje účinnost přibližně 50-60%, s pouze mírné změny při další expozici UDG. Nastavili jsme tak optimální dobu expozice na jednu hodinu. Kromě toho naše údaje jasně ukazují zvýšenou účinnost štěpení s rostoucím počtem dU, od 40 do 60% (obr. 3C a S1).

poté jsme se přesunuli ke studiu skutečného štěpného kroku, odstranění abasického místa po vyříznutí základny uracilu., Následující známé strategie pro chemicky indukované základním místo štěpení v solution20,30, výsledné AP-stránky byly pak štěpí buď za alkalických podmínek ponořením pole do 1:1 (v/v) roztok ethylendiamin(EDA)/ethanol, nebo pole byli léčeni v kyselém prostředí ponořením do 30% (v/v) roztoku kyseliny trichloroctové v dichlormethanu, nebo odpařením povrchu pole do sucha. Ve všech metodách byla léčba prováděna po různé časové období, od 1 do 24 hodin., Následně pole byly rehybridized na Cy3-označeny doplňující 25mer oligonukleotid (QC25c) a výsledné intenzity fluorescence byly porovnány s výsledky získanými před UDG léčby, aby bylo možné určit účinnost štěpení. Výsledné míry štěpení jsou uvedeny na obr. 4.

za základních podmínek (obr. 4B), štěpení míst AP vyžaduje minimální inkubační dobu 2 hodin, aby bylo možné pozorovat významné štěpení (40 až 60%) substrátů. Nicméně, ošetření pole kyselinou nebo sušení jeho povrchu(obr., 4A,C) výsledky v jasné a rozsáhlé štěpení po jednu hodinu (30 až téměř 80% s kyselým léčby), když EDA-zprostředkované základním místo štěpení je minimální po jedné hodině. Je pravděpodobné, že reakce štěpení se v a C metod je podporována v konečné fázi hybridizace, a to buď v důsledku teploty nebo přítomnosti aminů ve vyrovnávací paměti., Nicméně, protože hybridizace je společné pro všechny tři metody, velké rozdíly v kinetika štěpení mezi základní a non-základní ošetření naznačuje možnost, že další AP stránky mohou být vyrobeny v přítomnosti kyseliny, nebo za sníženého tlaku, čímž se získá další pozice na DNA, na které po štěpení reakce může nastat. Delší ošetření, bez ohledu na metodu, významně nemění rozsah štěpení, obvykle se blíží 40% až 80% v závislosti na počtu dU začlenění., Ve skutečnosti vidíme jasné celkové zvýšení účinnosti štěpení s rostoucím počtem du-incorporations za všech testovaných podmínek.

kromě chemicky indukovaného štěpení DNA na místech abasického místa byla zkoumána kvalita povrchu mikroarray. Za tímto účelem byla monitorována jednotnost vlastností na plochách pole na základě intenzit fluorescence a ztráty fluorescence pro nerozštěpitelné kontrolní prameny., Zjistili jsme, že základním stránky štěpení za alkalických podmínek povoleno pro konkrétní enzym zprostředkované štěpení dU-obsahující sekvence, ale odešla řídící sekvence prakticky beze změny, vzhledem k tomu, že v kyselém prostředí, DNA štěpení byl také pozorován pro kontrolu prameny chybí uracil nukleotidů (Obr. S2). Sušení povrchu také vedlo k degradaci řídicích pramenů pouze pro DT. Protože pouze abazické štěpení místa za alkalických podmínek zabraňuje degradaci povrchu a nespecifické ztrátě DNA, provedli jsme za těchto podmínek všechny následné experimenty., Tím je zajištěno, že nerozštěpitelné kontrolní sekvence zůstanou k dispozici pro srovnání i po dlouhém chemickém ošetření.

Single – a double-stranded UDG sekvence závislost

Protože naše výsledky na E. coli UDG-zprostředkované dU štěpení dodávány pouze mírný výstřih účinnosti pro vlákna DNA obsahující jeden dU incorporations (≈40%), vyslechli jsme sekvence specificita UDG s cílem identifikovat potenciálně vysoce-štěpí dU-obsahující substrát. Za tímto účelem jsme navrhli knihovnu nukleových kyselin obsahující du z dvojitých a jednovláknových sekvencí DNA., Knihovna se skládá ze 7mer permutovatelné sekvence s jedním dU uprostřed (obr. 5). Permutace 3-NT lemujících regionů, 5 ‚- stejně jako 3 ‚ dU má za následek 4096 jedinečných sekvencí. Ve dvouvláknovém formátu byla přidána smyčka a doplňková sekvence k 7meru, což vedlo k vytvoření struktury vlásenky. Další páry bází DG * dC V kmeni vlásenky pomohly zvýšit teplotu tání struktury DNA vlásenky. Tyto základní páry byly přidány do jednovláknových substrátů, aby se konstrukce ssDNA a dsDNA udržely co nejpodobnější., Konečně, 25mer oligonukleotid byl přidán k 5 ‚ – konci každého návrhu, aby sloužil jako hybridizační cíl. Reprezentativní obrázek sekvenčních návrhů je znázorněn na obr. 5.

i když terminálu značení DNA s fluorescenční barvivo je pohodlný způsob, jak přímo měřit fluorescenční intenzity, to s sebou nese tu nevýhodu, vysoké fluorescence hluku, který, zejména na high-density microarrays, dělá extrakce dat a interpretace obtížnější. Proto jsme se rozhodli sledovat štěpnou reakci hybridizací na imobilizované sekvence., Před léčbou UDG byly jednovláknové a dvouvláknové substráty DNA hybridizovány na značený komplementární oligonukleotid 25m a skenovány, aby se získaly počáteční hodnoty fluorescence. Poté byly mikroarrény vystaveny UDG pro různá časová období. Po následujícím štěpení na místě AP za alkalických podmínek byla pole opět hybridizována s jejich doplňky značenými Cy3. Snížení fluorescenčního signálu řetězců DNA vzhledem k hodnotám fluorescence před léčbou odpovídá přímo účinnosti štěpení., Maximální štěpení účinnosti kolem 40% byly získány pro double-stranded substráty po UDG inkubace po dobu 2 minut, a mírně nižší štěpení sazby pro single-stranded substráty (Tabulka č. 1). Tato nižší sazba pro single-stranded rozporu s dřívější studií, což naznačuje, že, že oni jsou štěpí rychleji než jejich dvojité-pletl equivalents13,47,48. Zajímavé je, že velmi krátké inkubace enzymů (<1 min) stále vedou k významné účinnosti štěpení (30-35%)., Tyto krátké časové body jsou obzvláště zajímavé, protože poskytují jasné náznaky potenciálních preferencí sekvence. Abychom identifikovali sekvenční závislost v degradaci DNA zprostředkované UDG z naší sady 4096 jednotlivých pramenů, zaměřili jsme se na 1% (obr. 6)stejně jako 5% (obr. S3) z nejvíce a nejméně štěpené podmnožiny sekvencí. Reprezentativní sekvenční motivy generované z těchto sekvenčních podmnožin jsou znázorněny na obr. 6 a v doplňujících informacích.,

pro dvouvláknovou DNA (obr. 6A, B), výsledky ukazují jasnou preferenci sekvence UDG pro regiony bohaté na G / C lemující uracil. Naopak, zdá se, že UDG špatně zpracovává dvojvláknové substráty obsahující páry bází t * a. Motivy extrahované z lepších a chudších substrátů UDG jsou částečně v souladu s velmi omezenými existujícími literárními daty48,49,50. Seibert et al., předpokládal, že účinnost E. coli UDG se vztahuje k energetické náklady DNA ohýbání a deformace vyskytující se v procesu specifické poškození uznání. V molekulární dynamiky simulace a time-resolved fluorescence experimenty s dvěma uracil-obsahující dvojí pletl DNA sekvence, které identifikovali, že efektivní ohýbací síly konstanty jsou nižší, pokud dAs nebo dTs se nachází v blízkosti uracil nukleotidů, místo gř a dCs; což naznačuje, že dA/dT-bohaté sekvence, by mohlo být více snadno ohnuté UDG a tak lépe processed49., Od single-stranded DNA je mnohem více flexibilní forma DNA, její rychlejší zpracování je uvedeno v literatuře může být vzhledem k nižší energetické náklady štěpí substráty, které jsou ze své podstaty pružnější než dsDNA7,47,49,51. Ohýbání nemusí však být rozhodujícím faktorem v UDG štěpení specifičnost ssDNA, enzym, který rozpoznává a štěpí všechny substráty stejně dobře, což možná vysvětluje absenci pořadí konsensu v dU-obsahující ssDNA., Přesto to bylo předpokládal, že sekvence kontextu účinky ještě rozšířit na single-stranded DNA, a dokonce byly pozorovány pro UDG z herpes simplex virus typ 152, ale stále zůstává nejasné, pro lidskou nebo E. coli UDG. Slupphaug et al. měřené sekvence specificita Lidských UDG v 34 dsDNA sekvence souvislostech a se domníval, že dT 3′ dU vždy výsledky v pomalé odstranění co udělal, poněkud falešně, vysoké GC content50. Eftedal et al. vyhodnocena účinnost štěpení obou tele brzlíku a E. coli UDG z 41 dsDNA sekvencí a našel podobný vzor., S naší mnohem větší sadu sekvencí, můžeme se shodují, že dT 3′ dU vždy výsledky v pomalé odstranění, ale naše data jasně ukazují, že dC a dG v menší míře, 3′ dU následek rychlé odstranění. Nebyli jsme schopni identifikovat významnou sekvenční závislost na excizi dU na ssDNA (obr. 6C, D). Je třeba poznamenat, že posloupnost závislost v dsDNA substrátů je jasné, pro krátké enzymatické ošetření (5s, 30s, 60s, 120s), ale pomalu mizí na delší UDG expozice (30min), což naznačuje, že všechny podklady jsou nakonec štěpí, když je vystavena enzymu.,

Restrikčním místě optimalizace

Od té doby žádné významné sekvence závislost pro UDG-zprostředkované uracil excize na single-stranded DNA vynořil z našich studií a spíše mírný výstřih efektivnosti pro jednotlivé dU incorporations byly získány, jsme se rozhodli studovat UDG-zprostředkované dU excize na delší single-stranded substráty obsahující různé formy více takových incorporations, zaměřené na identifikaci specifických štěpení stránky, které jsou snadno enzymaticky přístupné a umožňují rychlé a efektivní pramen štěpení., Naše zdůvodnění je, že zvyšující se vzdálenost sondy od povrchu by měla zajistit větší dostupnost pro štěpení, ale tento účinek nemusí přenášet na dlouhé distanční (>20-nt)53. Na základě výsledků z obr. 3, můžeme také očekávat, že vyšší počet dU začlenění povede k celkově větší výstřih, ale zajímalo by mě, jestli existuje optimální hustota dU nukleotidů v štěpitelné úsek vlákna DNA. Proto jsme zkoumali štěpení uracilu na delších homopolymerech dU (10, 15 a 20mers), jakož i na oligomerech s různým složením %dU., Procento dU v oligomeru byla vypočtena v poměru k ostatní čtyři nukleotidy (dA, dC, dG a dT) a experimentálně dosaženo provedením spojovacích reakcí s pre-smíšené řešení, dU/dA/dC/dG/dT phosphoramidites v různých poměrech (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 nebo 100:0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). Sekvence, postavený na poly-dT linkery různých délek (dT1, dT5, dT10 a dT15), a dU-obsahující regionu byla pak ukončena s 25mer cílové sekvence pro účely hybridizace, jak je uvedeno na Obr. 7.,

Po syntéze, 25mer byl křížený jeho komplementární 5′-Cy3 značený oligonukleotid a microarray byla vystavena UDG dobu 1 hodiny., Poté bylo štěpení abasického místa provedeno za alkalických podmínek a následná konečná rehybridizace. Současně jsme také provedli štěpení testu s UŽIVATELEM enzym, který je v tomto případě eliminuje potřebu dodatečné základním stránky štěpení postup.

pro enzymový test s UDG následovaný abazickým štěpením místa za alkalických podmínek (obr. 7, vlevo), Zaznamenali jsme účinnost štěpení v rozmezí od 4% do 80% a objevují se jasné trendy., Například, štěpení účinnost se zvyšuje výrazně s rostoucí délkou dU-obsahující regionu, v pořadí 10mer > 15mer > 20mer, s maximálně ~50% štěpení dosažitelné pro 10mer dU regionu, a 80% maximální pro 20mer dU regionu. Podobně, delší linkers má za následek celkově vyšší rychlost štěpení. Tato pozorování ukazují, že delší sekvence jsou lépe rozpoznány a odpovídající báze uracilu lépe vyříznuty UDG, což zase naznačuje větší dostupnost delších substrátů enzymem., Účinnost štěpení je také ovlivněna množstvím dU nukleotidů v štěpitelné části substrátu. Opravdu, uracil homopolymery (100%dU) jsou téměř vždy méně štěpí než jejich kongenerů se střídají dU nukleotidů, a tento účinek je zvláště jasné, kdy substráty jsou syntetizovány během krátké T1 linker. Na druhou stranu, zvýšení obsahu dU z 12 na 50% se setkává se zvyšující se účinností štěpení, přičemž optimální množství se jeví jako 50% dU., Za našich experimentálních podmínek bylo tedy štěpení zprostředkované UDG nejúčinnější na nejdelších substrátech, kde polovina nukleotidů v štěpitelné části je dU (účinnost štěpení 80%). Tento trend, stejně jako údaje uvedené na obr. 3, naznačuje, že UDG může rozpoznat a vázat se na více du začlenění, pokud jsou dUs odděleny kanonickými nukleotidy DNA.

Zatímco krátké homopolymery jsou obecně známé pro bytí ubohé UDG substráty, jsme také očekává, že dodržovat nízké štěpení sazby pro 20mer štěpitelné regiony, neboť tyto substráty jsou nepravděpodobné, že budou nalezeny v DNA., In vivo, uracil základny především se vyskytují v DNA vzhledem k misincorporation během replikace nebo v důsledku deamination8,9 a oba procesy jsou nepravděpodobné, že by na tak vysoké frekvenci formě homopolymery. Byly však získány mírné až vysoké účinnosti štěpení přibližně 60% U dlouhých homopolymerů 20mer dU, ale zda jsou tyto homopolymery zpracovávány pomaleji než substráty s nižším obsahem %dU, je třeba zkoumat.

zpracování podobné knihovny dna pole pomocí uživatelského enzymatického systému (obr., 7, vpravo) vede k uspokojivému štěpení jednovláknových substrátů, s trendy štěpení poněkud srovnatelnými s případem UDG, ale s několika pozoruhodnými výjimkami. První, nejvyšší štěpení účinnost je nižší než u UDG/EDA systém (55% versus 80%, respektive), což lze přičíst na pomalejší zpracování základním stránky s Endonukleasou VIII ve srovnání s společné základní ošetření s EDA., Za druhé, tam se zdá být slabší, délka diskriminace v štěpitelné regionu ve srovnání s UDG/EDA, pouze 20-25% rozdíl v nejvíce mezi krátkou (10-nt) a dlouhé (20-nt) dU-obsahující regionů, kdy UDG sama léčba vedla k velké rozdíly ve štěpení účinnost samé 10 a 20mers (až 50% rozdíl). Tento efekt může být opět způsoben rozdíly v rychlosti zpracování stránek AP. Nakonec se zdá, že homopolymery dU jsou degradovány ve stejném rozsahu, bez ohledu na délku linkeru nebo substrátu., Tento nedostatek diskriminace v případě enzymu uživatele a ve srovnání s údaji o štěpení zprostředkovanými UDG naznačuje, že existence více po sobě jdoucích míst AP je omezujícím faktorem při enzymatickém odstranění míst AP.

Abychom to shrnuli, v našich rukou, jsme zjistili, že nejlepší štěpení efektivity může být dosaženo s UDG-zprostředkované štěpení následuje EDA léčba na delší dobu, non-homopolymeric uracil-obsahující substráty. Přitom jednovláknové sekvence obsahující 50% dU lze efektivně štěpit, i když ve dvou krocích., Krátké, single-krok léčby s UŽIVATELEM enzymu koktejl může také pohodlně štěpit až 50% dU-obsahující jeden pramenů v jednu hodinu, nicméně, zřejmě nižší diskriminační výkon tohoto konkrétního enzymatické léčby může být méně užitečné, když preferenční štěpení je zapotřebí.