Lungeevaluering. Lungefunktionstest (PFT) blev udført med et Brent Spirood Spirometer på vores kontor. Nogle patienter havde gennemgået test andre steder.
Immunforsvarstest. Test blev udført på Immunvidenskabslaboratorier under ledelse af A. A.ojdani, Ph. D.. I betragtning af betydningen af disse test i forbindelse med denne evaluering er metoden beskrevet detaljeret.,
Forberedelse af formaldehyd-human serum albumin (F-HSA) og Formaldehyd-bovint serum albumin (F-BSA) konjugater:
Elektroforese og immunoelectrophoretic sammenligning af HSA, BSA Med F-HSA-og F-BSA blev udført for at bestemme konjugation forekomst. Konjugation blev påvist ved ændret mobilitet af f-HSA, F-BSA, når den blev sammenlignet med henholdsvis HSA eller BSA. Desuden blev antallet af frie amino add grupper til stede i F-HSA eller F-BSA bestemt ved metoden for Snyder og sobocinski (1975) og blev anvendt til at vurdere mængden af substitution., Antallet af aminogrupper bundet til formaldehyd var 26 for HSA og 31 for BSA. I denne beregning blev dannelsen af intermolekylær tværbinding overvejet.
fremstilling af toluendiisocyanat-humant serumalbumin (TDI-HSA) og bovint serumalbumin (TDI-BSA) konjugater:
dette præparat svarede til metoderne for de .ar og Baur (1982). Ifølge denne metode, 1g HSA eller 1g BSA blev opløst i 100 ml bufferopløsning, der indeholder kalium, chlorid (0.05 mol/l), natriumkarbonat (0.05 mol/l), PH-9.4 og afkølet til 4 C. Dioxan (10 ml) med 0.,15 ml toluendiisocyanat blev derpå tilsat dråbevis under omrøring over en periode på 3 timer efterfulgt af tilsætning af 2 ml ethanolamin, centrifugering, dialysefiltrering og lyofilisering. I lighed med F-HSA og F-BSA blev konjugation bekræftet ved elektroforese og bestemmelse af frie aminogrupper, der var til stede i konjugatet. Antallet af aminogrupper bundet til TDI var 37 for HSA og 43 for BSA. Ud over, spektrografisk analyse af konjugatet blev foretaget ifølge .eiss et. al. (1980)., Der var en markant stigning i absorptionen fra 230 til 260 nm, hvilket indikerede, at TDI var blevet kovalent forbundet med proteinbæreren. Denne stigning i absorption gjorde enig med NH2 gruppe bestemmelse kun 76% for HSA og 81% for BSA
Forberedelse af trimellitic anhydrid-human serum albumin (TMA-HSA) og Trimellitic anhydrid bovint serum albumin (TMA-BSA):
for At forberede disse konjugater 25 mg. af TMA blev opløst i 0,5 ml Dio .an og tilsat dråbevis enten til 25 mg HSA eller BSA opløst i 5 ml koldt 7% NaHCO3 i vand., Efter omrøring i 60 minutter ved 4 C blev konjugaterne dialyseret mod fire ændringer på 0,1 M NaHCO3 og en ændring af buffer. Endelig blev konjugaterne filtreret og holdt ved -20 C, indtil de blev brugt. OD-analyser af TMA-HSA og TMA-BSA blev udført for at bestemme antallet af TMA-rester, der er knyttet til det tilsvarende bærerprotein. Koncentrationen af bærerproteinet blev omdannet til molær koncentration med molekylvægten af HSA og BSA. Ud fra forholdet mellem den molære koncentration af TMA-liganden og proteinbæreren blev forholdet mellem TMA-rester pr., TMA – HSA blev estimeret til at indeholde 5 TMA-rester pr.HSA-molekyler og for TMA-BSA syv rester pr. albumin-molekyle (pien et al., 1988).
Forberedelse af phthalsyreanhydrid-human serum albumin (PA-HSA) og phthalsyreanhydrid bovint serum albumin (PA-BSA) konjugater:
Disse hapten-konjugater blev forberedt ved at tilføje 75 mg PA at en afkølet opløsning på 300 mg HSA eller BSA i 100 ml H2O. Reaktionsblandingen blev omrørt natten over, dialyzed mod 0,1 M PBS ved hjælp af slangerne med en cutoff på 8000 dalton. Ved hjælp af metoden til .eiss et. al. (1977) de molære forhold blev beregnet., De molære forhold blev fundet at være 22/28 for PA/HSA og 25/30 for PA / BSA.
Forberedelse af benzen ring HSA (B-HSA) og Benzen-ring BSA (B-BSA) konjugater:
For disse præparater, 40 mg. af P-aminoben .oesyre blev opløst i 2 ml 1 n HCL og afkølet ved nedsænkning i et isbad. En kold opløsning på 14 mg/ml blev tilsat dråbevis. Efter hver tilsætning blev blandingen omrørt i 30 sekunder. I parallel, et gram af HSA eller BSA blev opløst i borsyre 0.16 M natriumchlorid (0-15 M) buffer PH 9.0 (PH blev rejst med NaOH)., Bægrene indeholdende opløsninger af albuminer blev omgivet af et isbad på magnetisk omrører. Opløsningen af dia .oniumsalt blev tilsat dråbevis under hurtig omrøring til den kolde proteinopløsning. Efter tilsætning af hver dråbe justeres PH-værdien til 9,0 til 9,5 med en normal NaOH. Når al opløsningen var tilsat, fik reaktionen lov til at fortsætte med langsom omrøring i mindst en time med yderligere tilsætninger af NaOH-opløsning og opretholdelse af PH-værdien i området fra 9,0 til 9,5., Ureagerede små molekyler blev fjernet ved omfattende dialyse eller ved passage gennem en søjle af sephade.g-25 i det kolde rum, med en isotonisk saltopløsning som eluerende buffer. OD-analyser af orange farveudvikling af B-HSA og B-BSA blev udført for at bestemme antallet af B-rester, der er knyttet til det tilsvarende bærerprotein. Mængden af B substitution for HSA var ca 41 og for BSA 53 (Migrdichian, 1957).
Antistof Bestemmelse:
Specifikke antistoffer mod F-HSA, TDI-HSA -, TMA-HSA, PA-HSA-og B-HSA blev analyseret ved en ikke-kompetitive ELISA-analysen., Brønde af mikrotiter-plader (Dynatech, Alexandria, VA) var belagt med 100 1 af antigen-løsninger (100 g/ml) i 0,1 M PBS, PH 7,2 natten over ved 4 C. Plader blev vasket 4 gange med 0,1 M PBS indeholdende 0,05% tween 20 mellem hvert trin. Frie absorptionssteder blev blokeret med 2% proteasefrit bovint serumalbumin ved stuetemperatur i 4 timer og opbevaret ved -20 C, indtil de blev brugt.,
Analytisk Fremgangsmåde:
Den procedure, der omfattede følgende: (1) fire gange, (2) tilsætning af 100 1 af fortyndet serum (1:2 for IgE og 1:100 for IgM og IgG) i PBS, tween-20 med 1% BSA (3) inkubation for 4 timer ved 20 C, efterfulgt af vask 4 gange, (4) ud af 100 1 af en optimal fortynding af alkalisk phosphatase markeret affinitet renset gede-anti-humant IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) og anti-IgG (1:1000), købt fra KPI (Maryland) (5) inkubation i 120 minutter ved 20 C, (6) vask 6 gange, (7) ud af 100 1 P-nitrophenyl phosphate (Sigma Chemical Co.,) (8) inkubation i 60 minutter ved 20 C (9) tilsætning af 50 1 af 3 N natriumhydro .idopløsning, og (10) dobbelt læsning. Resultaterne blev beregnet ud fra absorbanser af duplikatprøver på 405 nm ved anvendelse af mikrotiterlæser. Alle prøver blev aflæst mod et HSA-antigen som en kontrol af binding, der ikke var specifik for F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA og B-HSA. Resultaterne blev udtrykt som titer. Titer er den sidste fortynding af serum, der giver absorption to gange af HSA-kontrol.,
Specificitets-og Krydshæmningsundersøgelser:
til bestemmelse af antistofspecificitet blev der foretaget en krydshæmningsundersøgelse. Positive sera for hvert hapten-proteinkonjugat blev kørt efter passende inkubation og udfældning med ti gange stigende trin af hapten bundet HSA eller BSA som hæmmere til at dække området for antistof mod antigenoverskud. Dette interval var mellem 50 g til 1000 g for hapten-BSA og 80 g til 1000 g for hapten-RSA., Efter inkubation ved 37 C og fjernelse af bundfald ved centrifugering blev prøverne fra før og efter krydshæmningsundersøgelse derefter anbragt på plader med brønde belagt med det specifikke konjugat. De efterfølgende trin blev fulgt som beskrevet ovenfor for ELISA-undersøgelsen.
IgG-og IgM-antistofbinding til forskellige konjugater blev hæmmet af hapten-HSA eller hapten-BSA fra 36-85%. Ved en given koncentration hæmmede både hapten-HSA og hapten-BSA antistofniveauet på lignende måde.,
delvis hæmning af IgE-antistofbinding til forskellige hapten-konjugater blev observeret, når serum blev præ-inkuberet med hapten-HSA eller hapten-BSA. Denne ufuldstændige observation af hæmning af IgE-antistof var hovedsageligt relateret til manglende tilgængelighed af serum med høje ige-titere mod forskellige kemikalier i vores laboratorium.,
Fastsættelsen af den Normale Niveauer af Antistoffer (Kontrol):
Baseret på ovenstående procedurer, 160 bloddonor prøver af raske personer, af begge køn, i alderen 22-55, blev undersøgt for antistof niveauer mod F-HSA, TD-HSA -, TMA-HSA, PA-HSA, og B-HSA. Den gennemsnitlige titer var 1: 800 400 for IgG, 1:3200 1600 for IgM og 1:8 4 for IgE. Således betragtes i vores laboratorietitere større end 1: 1600 for IgG, 1:6400 for IgM og 1:16 for IgE som positive.,
hos en given patient blev stigninger eller fald i antistoftitere med mere end en fortynding betragtet som signifikante (se tabeller).
Lymfocytundersæt tælling:
et enkelt laserflo cytcytometer (Epics Profile: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL) som diskriminerer fremad og retvinklet lys scatter, samt to farver, blev brugt med en soft .arepakke (Quuad Stat: Coulter). Mononukleære cellepopulationer blev bestemt ved tofarvet direkte immunofluorescens ved anvendelse af en helblod-farvningsteknik med det passende monoklonale antistof og Flo .cytometri (Fletcher et al.,, 1989) De følgende par af fluorescein phycoerythrin (FITC), eller phycoerythrin – (PE)-konjugeret monoklonale antistoffer (Coulter immunologi) blev valgt: T11-FUI/B4-FITC, T4-FUI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-forskning, udvikling og innovation og T11-FITC/Tal-PE til bestemmelse af T-celle – /B-celle -, T-hjælper/T-suppressor, NKHT3+ /NKHY3 og for alternativ vej af lymfocyt-aktivering hhv.
for at overvåge lymfocytmarkører blev der sat bat-kort på lymfocytpopulationen i fremadvinklet lysspredning versus et 90 lysspredningshistogram., Procentdelen af positivt farvede celler for hvert markørpar samt procentdelen af dobbeltfarvede celler blev bestemt. Estimater af absolutte antal lymfocytter positive for de respektive overflademarkører blev bestemt ved at multiplicere perifert lymfocytcelleantal med procentdelen af positivt farvede celler for hvert markørpar. Også procentdelen af dobbeltfarvede celler blev bestemt., Estimater af absolutte antal lymfocytter positive for de respektive overflademarkører blev bestemt ved at multiplicere perifert lymfocytcelleantal med procentdelen af positive celler for hver overflademarkør.
måling af anti-myelin basisk proteinantistoffer:
humant myelin basisk protein (HMBP) blev fremstillet ved metoden af Diebler et al. (1972) og kontrolleret for renhed ved polyacrylamingelelektroforese. Antiserum til HMBP blev induceret hos kaniner ved gentagen injektion af HMBP i komplet Freunds adjuvans., Antistof aktivitet i kanin sera og patientens prøver, der blev registreret ved at tilføje forskellige fortyndinger (1:100 og 1:10,000) af sera til brønde i en mikrotiterplade tidligere belagt med HMBP som følger: HMBP 250 g/ml blev opløst i carbonat buffer, PH 9.6 og 200 l af denne opløsning blev tilsat til hver brønd. Efter inkubation, vask og blokering som ovenfor blev 200 1 af enten fortyndet kanin eller humant serum tilsat til brøndene. Efter inkubation I I time ved 37 C blev seraen rystet ud af brøndene og derefter vasket 5 gange med vaskeopløsning., 200 1 af peroxidase-konjugeret ged anti-kanin eller ged anti-human IgG, IgM eller IgA (optimal fortynding) blev føjet til den relevante godt. Efter inkubation og gentagen vask blev der tilsat 200 1 ABTS-substrat til hver brønd. Plader blev inkuberet i en time ved stuetemperatur og læses i en mikrotiter læser ved 405 tun bølgelængde. Brug af kanin antisera; en titreringskurve blev afbildet, og patientens sera blev sammenlignet med denne standardkurve., Baseret på mere end 200 kontroller og patienters prøvebestemmelser blev liter større end 1:2000 for IgA, 1:5000 for IgM og 1:8000 for IgG betragtet som positive.