DNA-gelelektroforese er en teknik, der bruges til at adskille og identificere DNA-fragmenter baseret på størrelse.
DNA – fragmenter af forskellige størrelser lægges i en porøs gel fremstillet af agarose-et kulhydrat, der findes i røde alger.
når et elektrisk felt påføres, migrerer fragmenterne gennem gelen takket være de negativt ladede fosfatgrupper i DNA-nukleotider.
mindre stykker DNA vil lettere migrere gennem gelen end større fragmenter, som har en vanskeligere tid at bevæge sig gennem gelmatri theen.,
Når gelkørslen er afsluttet, kan placeringen af dine DNA-prøver sammenlignes med en række fragmenter eller bånd af kendte størrelser, kaldet en DNA-stige.
tilstedeværelsen af dit fragment af interesse kan derefter bekræftes ud fra dets størrelse, som bestemmes ved at sammenligne den relative placering af din testprøve med fragmenterne på stigen.
agarosegeler fremstilles under anvendelse af en vægt over volumenprocent opløsning. Så 1 gram agarose i 100 ml buffer vil gøre en 1% gel., Lavere procent geler vil bedre løse større fragmenter og højere procent geler vil gøre mindre fragmenter lettere at identificere. For at starte gelfremstillingsproceduren vejes den passende masse agarose ud i en Erlenmeyerkolbe.
tilsæt løbende buffer til kolben, så mængden af buffer ikke er større end 1/3 af kolbens kapacitet. Drej derefter for at blande.Smelt agarose/bufferblandingen ved opvarmning i mikrobølgeovn ved maksimal effekt. Hver tredive sekunder skal du fjerne kolben og hvirvle indholdet for at blande godt. Gentag, indtil agarosen er helt opløst.,
derefter tilsættes ethidiumbromid til en koncentration på 0, 5 mg / ml. Ethidiumbromid er en aromatisk forbindelse, der passer ind mellem individuelle basepar af DNA eller interkalater, og får DNA til at udsende intens orange fluorescens under UV-lys. Det er vigtigt at bemærke, at ethidiumbromid er kræftfremkaldende, så handsker bør altid bæres ved håndtering af geler, der indeholder denne forbindelse.
for at forhindre gelbakken i at vride sig, lad agarosen afkøle ved at placere den i et 65CC vandbad.
da agarosen afkøles, fremstilles gelformen ved at placere gelbakken i støbeapparatet., Som et alternativ kan du bruge tape til at forsegle de åbne kanter af gelbakken for at skabe formen. Placering af en kam i gelen skaber brøndene, hvor DNA er indlæst. Sørg for, at kammen skaber en brønd, der er den passende størrelse til din DNA-prøve.
hæld den smeltede agarose i gelformen og lad den hærde ved stuetemperatur.
efter at agarosen er hærdet, tag kammen ud. Hvis gelen ikke skal bruges med det samme, skal du pakke den i plastfolie og opbevare ved 4CC indtil brug.
hvis gelen skal bruges med det samme, skal du placere den i gelboksen.,
for at starte denne procedure tilsættes gelindlæsningsfarvestof til DNA-prøverne, der skal adskilles. Loading farvestof fremstilles typisk ved en 6 concentration koncentration. Indlæsning af farvestof hjælper med at visualisere og indlæse prøver i brøndene og hjælper med at bestemme, hvor langt prøverne er migreret under løbet.
Indstil strømforsyningen til den ønskede spænding.
Tilføj nu nok løbende buffer i gelboksen til at dække overfladen af gelen. Sørg for at bruge den samme løbende buffer som den, der bruges til at forberede gelen.
tilslut ledningerne på gelboksen til strømforsyningen, og tænd den., Husk, at DNA er negativt ladet og vil bevæge sig mod anoden, som er positiv og generelt rød i farve. Sørg for ikke at forbinde den sorte ledning eller katoden til bunden af gelboksen. Så du glemmer ikke, husk, at sorte katte er uflaks eller negative, og den sorte katode er derfor negativ. Kør din gel til rød, eller anoden. At kontrollere, at både gelboksen og strømforsyningen virker; udseendet af bobler ved elektroderne indikerer, at strømmen passerer igennem.
fjern låget på gelboksen., Læg langsomt og forsigtigt DNA-prøverne ind i gelen. Igen giver lastfarvestoffet i prøven prøven mulighed for at synke ned i gelen og hjælper med at spore, hvor langt prøven har rejst. En DNA – størrelse markør, eller stige, bør altid indlæses sammen med de eksperimentelle prøver.
udskift låget. Dobbelttjek, at elektroderne er tilsluttet de rigtige åbninger i strømforsyningen.tænd for strømmen. Kør gelen, indtil farvestoffet er migreret til en passende afstand.
når elektroforesekørslen er afsluttet, skal du slukke for strømforsyningen og fjerne låget på gelboksen.,
Fjern gelen fra gelboksen, og tøm overskydende buffer på overfladen af gelen. Placer gelbakken på papirhåndklæder for at absorbere resterende løbende buffer.
for at visualisere DNA-fragmenterne skal du fjerne gelen fra gelbakken og udsætte gelen for ultraviolet lys.
DNA-fragment skal vises som orange fluorescerende bånd. Tag et billede af gelen.
Ved afslutningen af eksperimentet skal du bortskaffe gelen og køre buffer korrekt pr. Igen, husk altid at håndtere gel og kører buffere med handsker for at undgå ethidium bromid eksponering.,
nu hvor du har set, hvordan du udfører DNA-gelelektroforese. Lad os se på nogle do .nstream-applikationer og variationer af denne meget nyttige metode.
Her ser du et agarosegelelektroforeseresultat efter adskillelse af PCR-produkter. DNA-fragmenterne, der er indlæst i gelen, er synlige som klart definerede bånd. DNA-standarden eller stigen skal adskilles i en grad, der giver mulighed for nyttig bestemmelse af størrelserne på prøvebåndene. I dette eksempel adskilles DNA-fragmenter af 765 basepar, 880 basepar og 1022 basepar på en 1.,5% agarosegel med en 2-log DNA-stige.
ud over at bekræfte tilstedeværelsen af et DNA-fragment af interesse kan DNA-gelelektroforese kombineres med gelrensningsprocedurer. Typisk bruges et barberblad til at skære DNA-fragmentet af interesse ud, så det kan indsamles og DNA-prøven i det genvindes.,
Agarose gel electrophesis kan også kombineres med overførsel blotting, som indebærer, at tillade DNA eller RNA, at overførsel til en cellulose-membran, hvor radioaktive prober, der kan bruges til at identificere specifikke DNA-eller RNA sekvenser i din electrophoretically-adskilt prøve.
Standard DNA-gelelektroforese er ikke ideel til adskillelse af DNA med høj molekylvægt større end 15-20 kb i størrelse, ligesom genomisk DNA. For at adskille store DNA-prøver anvendes pulsfeltgelelektroforese, hvilket indebærer at udsætte gelen for et skiftende eller pulserende elektrisk felt i forskellige retninger., Denne teknik involverer et specialiseret gelløbsapparat, som har par elektroder, der er anbragt i forskellige retninger omkring gelen. Dette kan bruges til at detektere forskelle i genomstørrelser mellem populationer af organismer, som de samlede DNA-prøver fra forskellige mikrobielle samfund, du ser her, som er taget fra forskellige sømiljøer.
du har lige set en introduktion til DNA-gelelektroforese., Vi viste dig konceptet bag metoden, hvordan man forbereder agarosegelen, hvordan man lægger dine prøver, hvordan man kører gelen og analyserer den og nogle almindelige anvendelser af agarosegelelektroforese. Tak for at se og held og lykke med at køre din gel.