Hvad er Flo ?cytometri (FACS-analyse)?

der Oprindeligt blev udviklet i slutningen af 1960’erne, flowcytometri er en populær analytiske celle-biologi teknik, der udnytter lyset til at tælle og profil celler i en heterogene væske blanding. Flo .cytometri er en særlig kraftfuld metode, fordi den giver en forsker mulighed for hurtigt, præcist og simpelthen at indsamle data relateret til mange parametre fra en heterogen væskeblanding indeholdende levende celler.,

flowcytometri er brugt flittigt gennem hele livet, og biomedicinske videnskaber, og kan anvendes i enhver situation, hvor en forsker nødt til hurtigt profil, har en stor population af løs celler i en flydende medier. For eksempel, i immunologi Flo .cytometri anvendes til at identificere, adskille, og karakterisere forskellige immun celle undertyper på grund af deres størrelse og morfologi.

Når yderligere oplysninger er påkrævet, antistoffer mærket med fluorescerende farvestoffer og hævet mod meget specifikke celleoverfladeantigener (f. eks., klynger af differentiering eller CD-markører) kan bruges til bedre at identificere og adskille specifikke underpopulationer inden for en større gruppe.

I et Flo .cytometer

• Prøveceller føres gennem en smal kanal en ad gangen.
• lys bruges til at belyse cellerne i kanalen.
• en række sensorer registrerer de typer lys, der brydes eller udsendes fra cellerne.
• data erhvervet af sensorerne er kompileret og integreret for at opbygge et omfattende billede af prøven.,

FACS-Antistoffer, der i øjeblikket anvendes til Forskning

Forskellige Typer af Lys, der anvendes i en Flow-Cytometri Eksperiment

Et flowcytometer bruger brydes eller udsendes lys til at tælle og identificere celler. Lær om forskellige typer lys, der bruges i et Flo .cytometri-eksperiment i de følgende figurer.,

Forward Scatter

Videresend spredt lys afbøjes af en celle i flow-kanal og fortsætter sammen i den lette vej (dvs samme retning, at lyset var oprindeligt rejser). Fremad spredt lys detekteres af en sensor i lysbanen og bruges typisk til at identificere partikelstørrelse.

fremad spredt lys bruges mest til at detektere objektets størrelse i lysbanen., Større objekter vil producere mere frem spredte lys end mindre objekter, og for større celler vil have en stærkere forward scatter signal

Side Scatter

Side spredte lys lys passerer fra den belysning, der er kilde til flow-kanal, er brydes af celler i en retning, der er uden for den oprindelige lys sti. Side-spredt lys detekteres af en sensor, der er ortogonal til den oprindelige lysbane.,

Side-spredt lys bruges normalt til at bestemme granulariteten og kompleksiteten af cellen i lysbanen. Meget granulære celler med en stor mængde intern kompleksitet, som neutrofiler, vil producere mere side-spredt lys og et højere side-scatter signal end celler med lav granularitet og kompleksitet.

Fluorescens-Emission

Fluorescerende lys, der udsendes af fluorescerende molekyler efter excitation af en kompatibel bølgelængde laser., Fluorescerende lys kan stamme fra naturligt fluorescerende materialer i cellen eller kan stamme fra fluorescerende farvestoffer eller fluorescensmærkede antistoffer, der er blevet brugt til at mærke en bestemt struktur på cellen.

Multiparametric Analyse

En mock flowcytometri dot-plot, planlægge fremad vs side-spredt fra en population af leukocytter., Cellepopulationer er præget af deres sandsynlige identitet:

D formodet affald, meget små genstande med lav lav fremad – og side – scatter.

L/M sandsynlige leukocytter/monocytter, små til mellemstore celler med lav intern kompleksitet / granularitet. Disse celler genererer en medium fremad-scatter og lav side-scatter signalintensitet

g sandsynlige granulocytter, store celler med høj intern kompleksitet / granularitet. Disse celler genererer høje fremad – og side-scatter signaler.,selvom nogle identiteter kan bekræftes af fremad-og sidescatterprofiler, giver mærkning med en cellespecifik markør altid større opløsning og sikkerhed, når man profilerer komplekse heterogene populationer af celler.

for eksempel i plottet ovenfor kan en forsker være i stand til at skelne mellem granulocytter og lymfocytter ved hjælp af fremad-og sidedistribueret lys. Imidlertid er tre klasser af granulocytter (neutrofiler, basofiler og eosinofiler) meget ens i størrelse og struktur, hvilket giver dem lignende lysspredningsegenskaber., I dette tilfælde kunne neutrofiler selektivt mærkes i kraft af deres udtryk en neutrofil specifik markør som ELANE.

FACS: Sortering af Celler, der er baseret på flowcytometri Data

De vilkår, flowcytometri og fluorescens-aktiveret cell sorting (FACS) bruges ofte i flæng. I praksis er der forskelle mellem de to metoder.

FACS er et derivat af Flo .cytometri, der tilføjer en ekstraordinær grad af funktionalitet. Ved hjælp af FACS kan en forsker fysisk sortere en heterogen blanding af celler i forskellige populationer.,

ved at bruge meget specifikke antistoffer mærket med fluorescerende farvestoffer kan en forsker udføre FACS-analyse og samtidig indsamle data om og sortere en prøve med et næsten ubegrænset antal forskellige parametre.

I et FACS-eksperiment:

• fremad-scatter, side-scatter og fluorescerende data indsamles som i konventionel Flo .cytometri.brugerdefinerede parametre giver oplysninger om, hvordan celler skal sorteres.
• baseret på disse parametre bruger FACS-maskinen en elektrode til at pålægge en elektrisk ladning på hver celle.,
• når elektromagneter forlader strømningskammeret, sorterer celler efter ladning i separate fartøjer.

Hvad ser Flo ?cytometri Data ud?

i et Flo .cytometri-eksperiment klassificeres hver celle, der passerer gennem Flo .cytometeret og detekteres, som en særskilt begivenhed.

Derudover, hver type lys, der er registreret af flowcytometer (forward scatter -, side-scatter, og hver bølgelængde af fluorescens-emission), vil få tildelt sin egen unikke kanal., Flo .cytometri data vil plotte hver begivenhed uafhængigt, og vil repræsentere signalintensiteten af lys detekteret i hver kanal for hver begivenhed.

flowcytometri data er typisk repræsenteret i en af to måder: histogrammer, der måler eller undersøg kun en enkelt parameter, og dot-plots, der sammenligner 2 eller 3 parametre samtidigt på en to – eller tre-dimensional scatter-plot.

et histogram viser typisk intensiteten detekteret i en enkelt kanal langs en akse, og antallet af hændelser detekteret ved denne intensitet er i en separat akse., Et stort antal hændelser, der registreres ved en bestemt intensitet, vises som en spids på histogrammet.

derimod, i en prik plot, hver begivenhed er repræsenteret som et enkelt punkt på en scatter-plot. Intensitet på 2 forskellige kanaler (eller 3 forskellige kanaler i et tredimensionalt plot) er repræsenteret langs de forskellige akser. Begivenheder med lignende intensiteter klynger sig sammen i den samme region på scatter-plottet.

histogrammer og dot-plots begge giver forskellige fordele for FLO .cytometri data analyse. At vælge, hvordan du bedst repræsenterer dine data, kan hjælpe med at sikre, at de fortæller en komplet historie i et enkelt, forståeligt format.

Dot-plots og histogrammer, er ikke gensidigt udelukkende, og de fleste komplekse flow-cytometri eksperimenter vil gøre brug af flere grunde til at vise rig, multi-parametriske data på en stikprøve.

i mange tilfælde skal mere end tre parametre afbildes samtidigt., I dette tilfælde kan en dataanalyseteknik kendt som gating hjælpe med at give yderligere opløsning og fleksibilitet, hvilket giver mulighed for analyse af en næsten ubegrænset mængde parametre samtidigt på tværs af flere forskellige scatter-plots og histogrammer.

Gating tilføjer opløsning til Flo .cytometri Data

kort sagt er gating en metode til valg af celler fra et Flo .cytometri eksperiment, som du vil analysere mere detaljeret., Gating tillader en forsker at indsamle og vise mere information om en underpopulation af celler end normalt kunne vises på en 2 – eller 3-dimensionel dot-plot.gating tilføjer opløsning til et Flo .cytometri-eksperiment og muliggør samtidig analyse af et næsten ubegrænset antal forskellige parametre (kanaler).

I et område flowcytometri Eksperiment:

• En bruger samler flowcytometri data fra en eller flere kanaler på en dot-plot.
• baseret på de indsamlede data tegner brugeren en portboks, der vælger en underpopulation af celler til yderligere analyse.,
• underpopulationen af celler i porten vil blive fremhævet specifikt på andre plot, der viser information fra alternative kanaler.Gates tilføjer en utrolig mængde fleksibilitet til Flo .cytometri, hvilket giver op til enkeltcelleopløsning for hver kanal, der er tilgængelig for forskeren. Flere porte kan etableres for et enkelt scatter-plot, og porte kan “stables” og kombineres (dvs.en underpopulation af celler, der er gated for i kanaler 1 og 2, kan yderligere gates for kanaler 3 og 4 for at muliggøre mere specificitet og dybere analyse).,
  

  et eksempel på gating

  En bemærkning om Kompensation

  Afsmitning fra én kanal til en anden, kan forårsage falsk positivt identificeret signaler. Spillover er det artefaktuelle signal, som et fluorescerende farvestof kan forårsage i kanalen til en anden fluorofor som en funktion af dets relative lysstyrke og emissionsspektrum. Det er her kompensation kommer i spil. Kompensation er en procedure, der isolerer signalet fra en bestemt kanal fra de andre kanaler, der bruges i det samme eksperiment. FITC f. eks., har sin emission top i det grønne område af det elektromagnetiske spektrum. Det fluorescerer dog også i den gule kanal, hvor PE udsender lys. Kort sagt trækker kompensation FITC-signalet fra PE-kanalen.

  dette signal i den “forkerte” kanal trækkes fra signalet forårsaget af fluoroforen af interesse. I ovenstående prøve er forholdet mellem den grønne og den gule komponent ved en given e .citationsbølgelængde konstant for FITC., Det er således muligt at udlede mængden af uspecifik gul FITC-signal i PE-kanalen fra målingen i den grønne kanal ved hjælp af de konstante kompensationskoefficienter. Det samme gælder for spillover fra PE ind i FITC-kanalen.