Specificitet og Effektiviteten af Uracil DNA glycosylase for-Medieret Strand Spaltning Adspurgte på Store Sekvens Biblioteker

UDG-medieret uracil excision og kemiske AP site spaltning på microarrays

DNA strand medieret spaltning af UDG består af to separate trin: excision af uracil base efterfulgt af spaltning af den resulterende en grundlæggende websted. De to trin kan overvåges separat på DNA-mikroarrays., For det første, grundlæggende steder er genereret ved at behandle array med UDG-og i et andet trin, strand spaltning er fremkaldt ved at udsætte overfladen-tøjret, DNA-oligonukleotider, der indeholder en grundlæggende websteder til enten sure eller grundlæggende betingelser, eller ved inddampning af overfladen til tørhed. Sådanne kemiske strategier til spaltning af abasiske steder på DNA-strenge eliminerer behovet for yderligere en .ymatisk spaltning og muliggør, at UDG-kinetik kan studeres uafhængigt., Til dette formål, arrays af 30mer DNA-sekvenser med et stigende antal af ikke-konsekutive dU-incorporations (dU1 – dU9) blev designet og syntetiseret af maskless nukleinsyre fotolitografiske, ved hjælp af de tilsvarende lysfølsomme dU phosphoramidite (Fig. 2). Hver DNA-streng blev syntetiseret med en dT15-linker til glasoverfladen og afsluttet ved 5 ‘ – enden med en 25mer målsekvens for hybridisering (.c25), som angivet i fig. 3.,

placeringen af alle probesekvenser sammen med tilsvarende replikater og kontrolstrenge, der bærer dT i stedet for du-nukleotider, blev randomiseret over mikroarray-overfladen., Før en .ymatisk behandling blev DNA-probesekvenserne hybridiseret til det Cy3-mærkede komplementære 25mer-oligonukleotid (.c25c) for at bestemme indledende fluorescensintensitetsværdier. 3 ‘ – Cy3 mærkning blev anvendt til at forhindre mulige fluorescens artefakter på grund af interaktioner af farvestoffet med det variable antal dUs46. Mikroarrayerne blev derefter udsat for kommercielt fremskaffede UDG fra E. coli, og den abasiske spaltning blev efterfølgende udført under forskellige betingelser. Den optimale en .ymeksponeringstid blev bestemt i indledende forsøg. Vores resultater (Fig., S1) viser, at spaltningseffektiviteten efter tilsætning af en .ymet stiger signifikant med tiden, op til en time, og når en effektivitet på omtrent 50-60%, med kun små ændringer ved yderligere eksponering for UDG. Vi indstiller således den optimale eksponeringstid til en time. Derudover viser vores data tydeligt øget spaltningseffektivitet med et stigende antal du, fra 40 til 60% (Fig. 3C og S1).

Vi fortsatte derefter med at studere det faktiske spaltningstrin, fjernelse af det abasiske sted efter udskæring af uracil-basen., Følgende kendte strategier for kemisk induceret en grundlæggende websted spaltning i solution20,30, hvilket resulterer AP-steder blev derefter kløves enten under alkaliske forhold ved at dyppe arrays i en 1:1 – (v/v) løsning af ethylendiamin(EDA)/ethanol, eller arrays blev behandlet under sure betingelser, ved at nedsænke i en 30% (v/v) løsning af trichloreddikesyre i dichlormethan, eller ved inddampning af overfladen af array til tørhed. I alle metoder blev behandlingerne udført i forskellige tidsperioder, der spænder fra 1 til 24 timer., Derefter blev arrayerne rehybridiseret til det Cy3-mærkede komplementære 25mer-oligonukleotid (.c25c), og de resulterende fluorescensintensiteter blev sammenlignet med dem, der blev opnået før UDG-behandling for at bestemme spaltningseffektiviteten. De resulterende spaltningshastigheder er angivet i Fig. 4.

under grundlæggende betingelser (fig. 4B) kræver spaltning af AP-steder en minimum inkubationsperiode på 2 timer for at observere signifikant spaltning (40 til 60%) af substraterne. Imidlertid behandles arrayet med en syre eller tørrer dens overflade (fig., 4A,C, henholdsvis) resultater i et klart og omfattende spaltning efter kun en time (30 til næsten 80% med en sur behandling), når EDA-medieret en grundlæggende websted spaltning er minimal efter en time. Det er sandsynligt, at spaltningsreaktionen i sig selv i A-og C-metoder fremmes ved det endelige hybridiseringstrin, enten på grund af temperatur eller tilstedeværelsen af en amin i bufferen., Ikke desto mindre, da hybridisering er fælles for alle tre metoder, de store forskelle i spaltning kinetik mellem grundlæggende og ikke-behandlinger antyder muligheden, at ekstra AP steder kan være produceret i tilstedeværelse af en syre, eller ved reduceret tryk, hvilket giver yderligere positioner på DNA-strenge, hvor en efterfølgende spaltning reaktion kan forekomme. Længere behandlinger, uanset metoden, ændrer ikke signifikant omfanget af spaltning, som normalt nærmer sig 40% til 80% afhængigt af antallet af du-inkorporeringer., Faktisk ser vi en klar samlet stigning i spaltningseffektivitet med et stigende antal du-inkorporeringer under alle testede forhold.

ud over at udføre kemisk induceret DNA-strengspaltning på abasiske stedplaceringer blev kvaliteten af mikroarray-overfladen undersøgt. Til dette formål blev ensartetheden af funktionerne på arrayoverfladerne visuelt inspiceret baseret på fluorescensintensiteter, og tab af fluorescens for de ikke-spaltelige kontrolstrenge blev overvåget., Vi fandt, at en grundlæggende websted spaltning under basiske betingelser tilladt for specifikke enzym medieret spaltning af dU-indeholder sekvenser, men venstre kontrol-sekvenser stort set urørt, der henviser til, at under sure betingelser, DNA-strand spaltning blev også observeret for kontrol tråde mangler uracil nukleotider (Fig. S2). Tørring af overfladen førte også til nedbrydning af DT-kun kontrolstrenge. Da kun abasisk spaltning under alkaliske forhold undgår overfladenedbrydning og ikke-specifikt tab af DNA, udførte vi alle efterfølgende eksperimenter under disse betingelser., Dette sikrer, at de ikke-spaltelige kontrolsekvenser forbliver tilgængelige til sammenligning, selv efter lang kemisk behandling.

Single – og dobbelt-strenget UDG sekvens afhængighed

Da vores resultater på E. coli UDG-medieret dU spaltning, der leveres kun moderat spaltning effektivitet til DNA-strenge, der indeholder en enkelt dU incorporations (≈40%), har vi forhørt sekvensen specificitet UDG for potentielt at kunne identificere et højt kløvet dU-med underlaget. Til dette formål designede vi et du – holdigt nukleinsyrebibliotek fra dobbelt-og enkeltstrengede DNA-sekvenser., Biblioteket består af en 7mer permutabel sekvens med en enkelt du i midten (Fig. 5). Permutation af de 3-nt flankerende regioner, 5 ‘- samt 3 ‘ af dU resulterer i 4096 unikke sekvenser. I det dobbeltstrengede format blev en løkke og den komplementære sekvens til 7meren tilsat, hvilket førte til dannelsen af en hårnålstruktur. Yderligere dG * dC-basepar i hårnålestammen hjalp med at øge smeltetemperaturen for hårnålens DNA-struktur. Disse basepar blev føjet til de enkeltstrengede underlag for at holde ssdna-og dsDNA-designene så ens som muligt., Endelig blev et 25mer oligonukleotid sat til 5 ‘ – enden af hvert design for at tjene som et hybridiseringsmål. En repræsentativ figur af sekvensdesignene er vist i fig. 5.

Selv om terminal mærkning af DNA med et fluorescerende farvestof er en praktisk metode til direkte at måle fluorescens intensitet, det medfører ulempe for høj fluorescens støj, som, især på high-density microarrays, gør udtræk af data og fortolkning mere vanskeligt. Derfor besluttede vi at overvåge spaltningsreaktionen via hybridisering til de immobiliserede sekvenser., Før behandling med UDG blev de enkelt – og dobbeltstrengede DNA-substrater hybridiseret til det mærkede komplementære 25mer-oligonukleotid og scannet for at opnå indledende fluorescensværdier. Derefter blev mikroarrays udsat for UDG i forskellige tidsperioder. Efter følgende AP-site spaltning under alkaliske betingelser blev arrays igen hybridiseret til deres Cy3-mærkede komplementer. Faldet i fluorescenssignal fra DNA-strengene i forhold til fluorescensværdier før behandling svarer direkte til spaltningseffektivitet., 40% blev opnået for dobbeltstrengede substrater efter UDG inkubation i 2 minutter og lidt lavere spaltningshastigheder for enkeltstrengede substrater (tabel S1). Denne lavere sats for enkeltstrenget modsiger tidligere undersøgelser,der indikerer,at de spaltes hurtigere end deres dobbeltstrengede ækvivalenter13, 47, 48. Interessant nok fører meget korte en .yminkubationer (<1 min) stadig til betydelige spaltningseffektiviteter (30-35%)., Disse korte tidspunkter er især interessante, da de giver klare antydninger til potentielle sekvenspræferencer. For at identificere sekvensafhængighed i UDG-medieret DNA-nedbrydning fra vores sæt af 4096 individuelle tråde fokuserede vi på 1% (fig. 6) samt 5% (Fig. S3) af den mest og mindst spaltede delmængde af sekvenser. Repræsentative sekvens motiver genereret fra disse sekvens undergrupper er vist i fig. 6 og i de supplerende oplysninger.,

for dobbeltstrenget DNA (fig. 6A, b), viser resultaterne en klar UDG-sekvenspræference for G/C-rige regioner, der flankerer uracil. Omvendt synes UDG at behandle dobbeltstrengede substrater, der indeholder t·a-basepar, Dårligt. Motiverne, der udvindes fra bedre og fattigere UDG-substrater, er delvis i overensstemmelse med de meget begrænsede eksisterende litteraturdata48,49,50. Seibert et al., hypotese, at effektiviteten af E. coli UDG er relateret til de energiske omkostninger ved DNA-bøjning og forvrængning, der forekommer i processen med specifik skadegenkendelse. I molecular dynamics simuleringer og tidsløst fluorescens eksperimenter med to uracil-indeholder dobbeltstrenget DNA-sekvenser, de har identificeret, at den effektive bøjning kraft konstanter er lavere, hvis dAs eller dTs, er placeret støder op til uracil nukleotid, i stedet for dGs og dCs; hvilket tyder på, at dA/dT-rige sekvenser kan være mere let bøjet ved UDG og dermed bedre processed49., Da enkeltstrenget DNA er en meget mere fleksibel form for DNA, kan dens hurtigere behandling rapporteret i litteraturen skyldes de lavere energiske omkostninger ved spaltning af substrater,der i sagens natur er mere fleksible end dsDNA7,47,49, 51. Bøjning kan dog ikke være en afgørende faktor i UDG spaltning specificitet af ssDNA, med enzymet genkende og spalte alle substrater lige godt, hvilket måske forklarer den manglende sekvens konsensus i dU-med ssDNA., Det blev ikke desto mindre antaget, at sekvenskontekstvirkninger stadig strækker sig til enkeltstrenget DNA, og faktisk var blevet observeret for UDG fra herpes simple.virus type 152, men er stadig uklart for human eller E. coli UDG. Slupphaug et al. målt sekvens specificitet af Menneskelige UDG i 34 dsDNA sekvens sammenhænge, og formodede, at dT ‘3’ for at dU altid resulterer i langsom fjernelse, som gjorde, noget discordantly, en høj GC content50. Eftedal et al. evaluerede spaltningseffektiviteten af både kalv thymus og E. coli UDG fra 41 dsDNA sekvenser og fandt et lignende mønster., Med vores langt større sæt sekvenser kan vi være enige om, at dt 3′ til du altid resulterer i langsom fjernelse, men vores data viser tydeligt, at dC og dG i mindre grad 3′ til du resulterer i hurtig fjernelse. Vi var ikke i stand til at identificere signifikant sekvensafhængighed for du e .cision på ssDNA (Fig. 6C, D). Det skal bemærkes, at sekvensen afhængighed i dsDNA substrater er klar til korte enzymatiske behandlinger (5s, 30s, 60s, og 120s), men langsomt forsvinder væk i længere tid UDG eksponering (30min), hvilket indikerer, at alle materialer er i sidste ende kløves, når de udsættes for enzymet.,

Spaltning site optimeringer

Da ingen væsentlig sekvens afhængighed for den UDG-medieret uracil excision på enkelt-strenget DNA er opstået ud fra vores undersøgelser og temmelig moderat spaltning effektivitetsgevinster for enkelt-dU incorporations blev indhentet, vi valgte at studere UDG-medieret dU excision på længere enkeltstrenget substrater, der indeholder forskellige former for flere dU incorporations, sigter mod at identificere konkrete spaltning websteder, der er let enzymatisk tilgængelig og giver mulighed for hurtig og effektiv strand spaltning., Vores begrundelse er, at forøgelse af sondens afstand fra overfladen skal give større tilgængelighed for spaltning, men denne effekt må ikke overføres til lange afstandsstykker (>20-nt)53. Baseret på resultaterne fra Fig. 3, forventer vi også, at et højere antal du-inkorporeringer vil føre til større samlet spaltning, men vi spekulerer på, om der er en optimal tæthed af du-nukleotider inden for det spaltelige afsnit af DNA-strengen. Derfor undersøgte vi uracil-spaltning på længere du-homopolymerer (10, 15 og 20mers) såvel som på oligomerer med varierende %du-sammensætning., Den procentdel af dU inden for de oligomer blev beregnet i forhold til de andre fire nukleotider (dA, dC, dG og dT) og eksperimentelt opnået ved at foretage en kobling reaktioner med præ-blandet løsninger af dU/dA/dC/dG/dT phosphoramidites i forskellige nøgletal (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 eller 100:0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). Sekvenserne, bygget på poly – dt linkers af varierende længder (DT1, DT5, dT10 og dT15), og det du-holdige område blev derefter afsluttet med en 25mer målsekvens til hybridiseringsformål som angivet i fig. 7.,

efter syntese blev 25meren hybridiseret til dets komplementære 5′-Cy3-mærkede oligonukleotid, og mikroarrayet blev eksponeret for UDG i 1 time., Derefter blev spaltning af det abasiske sted udført under alkaliske betingelser efterfulgt af en endelig rehybridisering. Parallelt udførte vi også spaltningsassayet med brugeren .ymet, hvilket i dette tilfælde eliminerer behovet for en yderligere abasisk spaltningsprocedure.

For en .ymet assay med UDG efterfulgt af abasisk sted spaltning under alkaliske betingelser (fig. 7, venstre), registrerede vi spaltningseffektiviteter, der spænder fra 4% op til 80% og med klare tendenser., For eksempel, spaltning effektivitet stiger betydeligt med stigende længde af dU-med-regionen, i den rækkefølge, 10mer > 15mer > 20mer, med et maksimum på ~50% spaltning tilgængelig for en 10mer dU regionen, og 80% maksimum for 20mer dU regionen. Tilsvarende resulterer længere linkere i en samlet højere spaltningshastighed. Disse observationer indikerer, at længere sekvenser genkendes bedre, og at de tilsvarende uracil-baser bedre udskæres af UDG, hvilket igen antyder en større tilgængelighed af de længere substrater af en .ymet., Spaltningseffektiviteten påvirkes også af mængden af du-nukleotider i den spaltelige del af substratet. Faktisk er uracil-homopolymerer (100% du) næsten altid mindre spaltet end deres kongenere med interspersed du-nukleotider, og denne effekt er især klar, når substraterne syntetiseres over en kort T1-linker. På den anden side mødes forøgelse af du-indholdet fra 12 til 50% med stigende spaltningseffektivitet, hvor 50% du ser ud til at være den optimale mængde., Under vores eksperimentelle betingelser var UDG-medieret spaltning således den mest effektive på de længste underlag, hvor halvdelen af nukleotiderne i den spaltelige del er dU (80% spaltningseffektivitet). Denne tendens, samt data vist i Fig. 3, antyder, at UDG kan genkende og binde til flere du-inkorporeringer, så længe du ‘ er adskilles af kanoniske DNA-nukleotider.mens korte homopolymerer generelt er kendt for at være dårlige UDG-substrater, forventede vi også at observere lave spaltningshastigheder for de 20mer-spaltelige regioner, da sådanne substrater sandsynligvis ikke findes i DNA., In vivo forekommer uracil-baser hovedsageligt i DNA-strenge på grund af misincorporation under replikation eller på grund af deaminering8,9, og begge processer forekommer sandsynligvis ikke ved en så høj frekvens til dannelse af homopolymerer. Ikke desto mindre blev der opnået moderat til høj spaltningseffektivitet på omkring 60% på lange 20mer du homopolymerer, men hvorvidt disse homopolymerer behandles langsommere end substrater med lavere %Du-indhold, skal stadig undersøges.

behandling af et lignende DNA-array-bibliotek med brugeren .ymsystemet (fig., 7, højre) fører til tilfredsstillende spaltning af enkeltstrengede substrater, med spaltningstendenser, der er noget sammenlignelige med UDG-sagen, men med nogle få bemærkelsesværdige undtagelser. For det første er den højeste spaltningseffektivitet lavere end for UDG/EDA-systemet (henholdsvis 55% mod 80%), hvilket kan tilskrives en langsommere behandling af de abasiske steder med Endonuclease VIII sammenlignet med en almindelig basisbehandling med EDA., For det andet, synes der at være en svagere længde forskelsbehandling i cleavable regionen i forhold til UDG/EDA, med kun 20-25% forskel på de fleste mellem kort (10-nt) og lang (20-nt) dU-indeholder regioner, når UDG alene behandling førte til store variationer i den spaltning effektiviteten af de samme 10 og 20mers (op til 50% forskel). Igen kan denne effekt skyldes forskelle i behandlingshastigheden for AP-sitesebsteder. Endelig synes du homopolymerer at blive nedbrudt i samme omfang, uanset linker eller substratlængde., Denne mangel på diskrimination i brugeren .ymet og sammenlignet med UDG-medierede spaltningsdata antyder, at eksistensen af flere, på hinanden følgende AP-steder er den begrænsende faktor i den en .ymatiske fjernelse af AP-steder.

for At opsummere, i vores hænder, vi har fundet, at den bedste spaltning effektivitet kan opnås med UDG-medieret spaltning efterfulgt af EDA behandling på længere, ikke-homopolymeric uracil-holdige materialer. Derved kan enkeltstrengede sekvenser indeholdende 50% du effektivt spaltes, omend i to trin., Et kort, enkelt-trins behandling med BRUGEREN enzym cocktail kan også bekvemt kløve op til 50% af dU-med kun et enkelt tråde i en time, men tilsyneladende lavere diskriminerende effekt af denne særlige enzymatisk behandling kan være mindre effektiv, når en favorabel spaltning er påkrævet.