SDS-Page (natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese) anvendes almindeligvis i laboratoriet til adskillelse af proteiner baseret på deres molekylvægt. Det er en af de teknikker, der er almindeligt anvendt, men ikke ofte fuldt forstået. Så lad os prøve at ordne det.
SDS-PAGE adskiller proteiner i henhold til deres molekylvægt, baseret på deres differentielle migrationshastigheder gennem en sigtematri. (en gel) under påvirkning af et påført elektrisk felt.,
at gøre Proteinmigrationshastigheden Proportional med molekylvægten
bevægelsen af enhver ladet art gennem et elektrisk felt bestemmes af dens nettoladning, dens molekylradius og størrelsen af det anvendte felt. Men problemet med naturligt foldede proteiner er, at hverken deres nettoladning eller deres molekylære radius er molekylvægt afhængig. I stedet bestemmes deres netladning ved aminosyresammensætning, dvs. summen af de positive og negative aminosyrer i proteinet og molekylærradius ved proteinets tertiære struktur.,
så i deres oprindelige tilstand ville forskellige proteiner med samme molekylvægt migrere med forskellige hastigheder i et elektrisk felt afhængigt af deres ladning og 3D-form.
for kun at adskille proteiner i et elektrisk felt baseret på deres molekylvægt, er vi nødt til at ødelægge den tertiære struktur ved at reducere proteinet til et lineært molekyle og på en eller anden måde maskere proteinets indre netladning. Det er her SDS kommer ind.,
Den Rolle, SDS (et al)
SDS er et rengøringsmiddel, der er til stede i SDS-PAGE sample buffer hvor den sammen med en smule kogende, og reduktionsmiddel (normalt DTT-eller B-MIG til at nedbryde protein-protein disulphide obligationer), der forstyrrer den tertiære struktur af proteiner. Dette bringer de foldede proteiner ned til lineære molekyler.
SDS dækker også proteinet med en ensartet negativ ladning, som maskerer de indre ladninger på R-grupperne. SDS binder temmelig ensartet til de lineære proteiner (omkring 1.,4g SDS / 1g protein), hvilket betyder, at ladningen af proteinet nu er omtrent proportional med dets molekylvægt.
SDS er også til stede i gelen for at sikre, at når proteinerne er lineariserede og deres ladninger maskeret, forbliver de på den måde under hele løbet.
den dominerende faktor ved bestemmelse af et SDS-belagt protein er dets molekylære radius., SDS-coatede proteiner har vist sig at være lineære molekyler, 18 Ångstrøm bred og med længde proportional med deres molekylvægt, så den molekylære radius (og dermed deres mobilitet i gelen) bestemmes af proteinets molekylvægt. Da de SDS-coatede proteiner har det samme ladnings – / masseforhold, vil der ikke være nogen differentiel migration baseret på ladning.
Gelmatri .en
i et anvendt elektrisk felt vil de SDS-behandlede proteiner nu bevæge sig mod den positive anode i forskellige hastigheder afhængigt af deres molekylvægt., Disse forskellige mobiliteter vil blive overdrevet på grund af højfriktionsmiljøet i en gelmatri..
Som navnet antyder, er gelen en matrix, der anvendes til SDS-PAGE er polyacrylamid, som er et godt valg, fordi det er kemisk inaktivt, og, ikke mindst, kan let gøres op i forskellige koncentrationer til at producere forskellige pore størrelser giver en række adskille forhold, der kan ændres, afhængigt af dine behov. Du kan huske, at jeg tidligere skrev en artikel om mekanismen for acrylamidpolymerisering.,
det diskontinuerlige buffersystem og Stablingsgelen – foring dem op ved startlinjen
for at lede strømmen fra katoden (negativ) til anoden (positiv) gennem gelen, er en buffer naturligvis nødvendig. For det meste bruger vi det diskontinuerlige Laemmli-buffersystem. “Diskontinuerlig” betyder simpelthen, at bufferen i gelen og tanken er forskellige.
systemet er typisk sat op med en stablingsgel ved pH 6.8, bufret af Tris-HCl, en løbende gel bufret til pH 8.8 af Tris-HCl og en elektrodebuffer ved pH 8.3., Stablingsgelen har en lav koncentration af acrylamid og den løbende gel en højere koncentration, der er i stand til at forsinke proteinernes bevægelse.
Så hvad er der med alle disse forskellige pH ‘ s?
Nå, glycin kan eksistere i tre forskellige ladningstilstande, positive, neutrale eller negative, afhængigt af pH. dette er vist i diagrammet nedenfor. Kontrol af glycins ladningstilstand ved de forskellige buffere er nøglen til hele stabling gel ting.,
Så her er, hvordan du stabler gel virker. Når strømmen er tændt, tvinges de negativt ladede glycinioner i pH 8.3-elektrodebufferen til at komme ind i stablingsgelen, hvor pH er 6,8. I dette miljø skifter glycin overvejende til den neutr .itterioniske (neutralt ladede) tilstand. Dette tab af ladning får dem til at bevæge sig meget langsomt i det elektriske felt.
Cl – ionerne (fra Tris-HCl) bevæger sig på den anden side meget hurtigere i det elektriske felt, og de danner en ionfront, der migrerer foran glycinen., Adskillelse af Cl – fra Tris counter-ion (som nu er på vej mod anoden) skaber en smal zone med en stejl spænding gradient, der trækker glycin sammen bag det, hvilket resulterer i to snævert adskilt fronter med at migrere ioner; den meget mobile Cl – front, efterfulgt af den langsommere, overvejende neutral glycin foran.,
Alle proteinerne i gelen prøven har en elektroforetiske mobilitet, der er mellem det yderste af mobiliteten af glycin og Cl-, så når de to fronter feje gennem prøven godt, de proteiner, der er koncentreret i den smalle zone mellem Cl – og glycin fronter.
og de er slukket!
denne procession fortsætter, indtil den rammer løbegelen, hvor pH-værdien skifter til 8.8. Ved denne pH er glycinmolekylerne for det meste negativt ladede og kan migrere meget hurtigere end proteinerne., Så glycinfronten accelererer forbi proteinerne og efterlader dem i støvet.
resultatet er, at proteinerne dumpes i et meget smalt bånd ved grænsefladen mellem stabling og løbende geler, og da løbegelen har en forøget acrylamidkoncentration, hvilket bremser proteinernes bevægelse i henhold til deres størrelse, begynder adskillelsen.
Hvad handlede alt det om?
Hvis du stadig undrer dig over, hvorfor stablingsgelen er nødvendig, skal du tænke på, hvad der ville ske, hvis du ikke brugte en.,
Gelbrønde er omkring 1 cm dybe, og du skal generelt fylde dem væsentligt for at få nok protein på gelen. Så i mangel af en stabling gel, din prøve ville sidde på toppen af den kørende gel, som et bånd på op til 1 cm dyb.
i Stedet for at blive linet op sammen og rammer, der kører gel sammen, dette ville betyde, at proteinerne i din prøve, ville alle indtaste kører gel på forskellige tidspunkter, hvilket resulterer i meget smurt bands.,
så stablingsgelen sikrer, at alle proteinerne ankommer til den løbende gel på samme tid, så proteiner med samme molekylvægt vil migrere som stramme bånd.
adskillelse
når proteinerne er i den løbende gel, adskilles de, fordi proteiner med højere molekylvægt bevæger sig langsommere gennem den porøse acrylamidgel end proteiner med lavere molekylvægt. Størrelsen på porerne i gelen kan ændres afhængigt af størrelsen på de proteiner, du vil adskille, ved at ændre acrylamidkoncentrationen. Typiske værdier er vist nedenfor.,
For en bredere adskillelse rækkevidde, eller for proteiner, der er svært at adskille, en gradient gel, der er lag af stigende akrylamid koncentration, der kan bruges.