Die DNA-Gelelektrophorese ist eine Technik zur Trennung und Identifizierung von DNA-Fragmenten basierend auf der Größe.
DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe werden in ein poröses Gel aus Agarose geladen-ein Kohlenhydrat, das in Rotalgen vorkommt.
Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wandern die Fragmente dank der negativ geladenen Phosphatgruppen in DNA-Nukleotiden durch das Gel.
Kleinere DNA-Stücke wandern leichter durch das Gel als größere Fragmente, die es schwieriger haben, sich durch die Gelmatrix zu bewegen.,
Wenn der Gellauf abgeschlossen ist, kann der Ort Ihrer DNA-Proben mit einer Reihe von Fragmenten oder Bändern bekannter Größe verglichen werden, die als DNA-Leiter bezeichnet werden.
Das Vorhandensein Ihres Fragments von Interesse kann dann anhand seiner Größe bestätigt werden, die durch Vergleich der relativen Position Ihrer Testprobe mit den Fragmenten der Leiter bestimmt wird.
Agarosegele werden unter Verwendung einer Gewichtsprozentsatzlösung hergestellt. So wird 1 Gramm Agarose in 100 ml Puffer ein 1% iges Gel bilden., Niedrigere Prozentgele lösen größere Fragmente besser auf, und höhere Prozentgele erleichtern die Identifizierung kleinerer Fragmente. Um mit der Gelherstellung zu beginnen, wiegen Sie die entsprechende Masse Agarose in einen Erlenmeyerkolben.
Fügen Sie dem Kolben laufenden Puffer hinzu, so dass das Puffervolumen nicht größer als 1/3 der Kapazität des Kolbens ist. Dann wirbeln zu mischen.
Schmelzen Sie das Agarose/Puffer-Gemisch durch Erhitzen in einer Mikrowelle mit maximaler Leistung. Entfernen Sie alle dreißig Sekunden den Kolben und wirbeln Sie den Inhalt, um ihn gut zu mischen. Wiederholen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.,
Als nächstes Ethidiumbromid in eine Konzentration von 0,5 mg/ml geben. Ethidiumbromid ist eine aromatische Verbindung, die zwischen einzelnen Basenpaaren von DNA oder Interkalaten passt und bewirkt, dass DNA unter UV-Licht intensive orangefarbene Fluoreszenz emittiert. Es ist wichtig zu beachten, dass Ethidiumbromid ein Karzinogen ist, daher sollten beim Umgang mit Gelen, die diese Verbindung enthalten, immer Handschuhe getragen werden.
Um ein Verziehen der Gelschale zu verhindern, lassen Sie die Agarose abkühlen, indem Sie sie in ein 65ºC-Wasserbad stellen.
Wenn die Agarose abkühlt, bereiten Sie die Gelform vor, indem Sie die Gelschale in die Gießvorrichtung legen., Alternativ können Sie die offenen Kanten der Gelschale mit Klebeband versiegeln, um die Form zu erstellen. Wenn Sie einen Kamm in das Gel legen, werden die Vertiefungen erzeugt, in denen DNA geladen ist. Stellen Sie sicher, dass der Kamm einen Brunnen erzeugt, der die richtige Größe für Ihre DNA-Probe hat.
Gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Gelform und lassen Sie sie bei Raumtemperatur aushärten.
Nachdem die agarose ausgehärtet ist, nehmen Sie den Kamm. Wenn das Gel nicht sofort verwendet wird, wickeln Sie es in Plastikfolie ein und lagern Sie es bis zur Verwendung bei 4 ° C.
Wenn das Gel sofort verwendet wird, legen Sie es in die Gelbox.,
Um mit diesem Verfahren zu beginnen, fügen Sie den zu trennenden DNA-Proben gelbeladenden Farbstoff hinzu. Der Farbstoff wird typischerweise in einer 6-fachen Konzentration hergestellt. Das Laden von Farbstoffen hilft beim Visualisieren und Laden von Proben in die Vertiefungen und hilft zu bestimmen, wie weit die Proben während des Laufs migriert sind.
stellen Sie die Stromversorgung auf die gewünschte Spannung.
Fügen Sie nun genügend Laufpuffer in die Gelbox ein, um die Oberfläche des Gels abzudecken. Stellen Sie sicher, dass Sie denselben Laufpuffer verwenden wie der zur Herstellung des Gels verwendete.
Schließen Sie die Leitungen der Gelbox an das Netzteil an und schalten Sie es ein., Denken Sie daran, dass DNA negativ geladen ist und sich in Richtung der Anode bewegt, die positiv und im Allgemeinen rot ist. Stellen Sie sicher, dass Sie die schwarze Leitung oder Kathode nicht an den Boden der Gelbox anschließen. Sie vergessen also nicht, dass schwarze Katzen Pech haben oder negativ sind und die schwarze KAThode daher negativ ist. Führen Sie Ihr Gel auf rot oder die Anode. Um zu überprüfen, ob sowohl die Gelbox als auch die Stromversorgung funktionieren; Das Auftreten von Blasen an den Elektroden zeigt an, dass Strom durchläuft.
Entfernen Sie den Deckel der Gelbox., Laden Sie die DNA-Proben langsam und vorsichtig in das Gel. Auch hier lässt der Ladefarbstoff in der Probe die Probe in das Gel sinken und hilft zu verfolgen, wie weit die Probe gereist ist. Ein DNA-Größenmarker oder Leiter sollte immer zusammen mit den experimentellen Proben geladen werden.
Deckel austauschen. Überprüfen Sie, ob die Elektroden in die richtigen Steckplätze in der Stromversorgung eingesteckt sind.
Schalten Sie die power. Führen Sie das Gel aus, bis der Farbstoff in eine geeignete Entfernung gewandert ist.
Wenn der Elektrophorese-Lauf abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und entfernen Sie den Deckel der Gelbox.,
Entfernen Sie das Gel aus der Gelbox und lassen Sie überschüssigen Puffer auf der Geloberfläche ab. Legen Sie das Gelfach auf Papiertücher, um den verbleibenden laufenden Puffer aufzunehmen.
Um die DNA-Fragmente zu visualisieren, entfernen Sie das Gel aus der Gelschale und setzen Sie das Gel ultraviolettem Licht aus.
DNA-Fragment sollte als orange fluoreszierende Bänder zeigen. Machen Sie ein Foto des Gels.
Entsorgen Sie das Gel und den laufenden Puffer am Ende des Experiments ordnungsgemäß gemäß den Vorschriften der Einrichtung. Denken Sie auch hier daran, das Gel und die laufenden Puffer immer mit Handschuhen zu behandeln, um eine Ethidiumbromidexposition zu vermeiden.,
Nun, da Sie gesehen haben, wie DNA-Gel-Elektrophorese durchzuführen. Schauen wir uns einige nachgelagerte Anwendungen und Variationen dieser sehr nützlichen Methode an.
Hier sehen Sie ein Agarosegelelektrophoreseergebnis nach dem Trennen von PCR-Produkten. Die in das Gel Gel geladenen DNA-Fragmente sind als klar definierte Bänder sichtbar. Der DNA-Standard oder die Leiter sollte so weit getrennt werden, dass die Größe der Probenbänder sinnvoll bestimmt werden kann. In diesem Beispiel werden DNA-Fragmente von 765 Basenpaaren, 880 Basenpaaren und 1022 Basenpaaren auf einer 1 getrennt.,5% Agarosegel mit einer 2-log DNA Leiter.
Zusätzlich zur Bestätigung des Vorhandenseins eines DNA-Fragments von Interesse kann die DNA-Gelelektrophorese mit Gelreinigungsverfahren kombiniert werden. Typischerweise wird eine Rasierklinge verwendet, um das DNA-Fragment von Interesse auszuschneiden, so dass es gesammelt und die darin enthaltene DNA-Probe wiederhergestellt werden kann.,
Agarosegelelektrophese kann auch mit Transfer-Blotting kombiniert werden, bei dem DNA oder RNA auf eine Zellulosemembran übertragen werden kann, wo radioaktive Sonden verwendet werden können, um spezifische DNA-oder RNA-Sequenzen in Ihrer elektrophoretisch getrennten Probe zu identifizieren.
Die Standard-DNA-Gelelektrophorese ist nicht ideal für die Trennung von DNA mit hohem Molekulargewicht, die größer als 15-20 kb ist, wie genomische DNA. Um große DNA-Proben zu trennen, wird die Pulsfeldgelelektrophorese verwendet, bei der das Gel einem sich ändernden oder pulsierenden elektrischen Feld in verschiedene Richtungen ausgesetzt wird., Bei dieser Technik handelt es sich um eine spezielle Gellaufvorrichtung, bei der Elektrodenpaare in verschiedenen Ausrichtungen um das Gel angeordnet sind. Dies kann verwendet werden, um Unterschiede in der Genomgröße zwischen Populationen von Organismen zu erkennen, wie die gepoolten DNA-Proben aus verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften, die Sie hier sehen, die aus verschiedenen Seeumgebungen entnommen werden.
Sie haben gerade eine Einführung in die DNA-Gelelektrophorese gesehen., Wir haben Ihnen das Konzept hinter der Methode gezeigt, wie Sie das Agarosegel vorbereiten, wie Sie Ihre Proben laden, wie Sie das Gel ausführen und analysieren und einige gängige Anwendungen der Agarosegelelektrophorese. Danke fürs Zuschauen und viel Glück beim Laufen deines Gels.