evaluación pulmonar. Las pruebas de función pulmonar (PFT) se realizaron con un espirómetro de Brentwood en nuestro consultorio. Algunos pacientes se habían sometido a pruebas en otros lugares.
pruebas inmunitarias. Las pruebas se realizaron en laboratorios de Inmunosciencias bajo la dirección de A. Wojdani, Ph. D.. En vista de la importancia de estas pruebas en el contexto de esta evaluación, la metodología se describe en detalle.,
preparación de conjugados formaldehído-albúmina sérica humana (F-HSA) y formaldehído-albúmina sérica bovina (F-BSA):
Se realizó una comparación electroforética e inmunoelectroforética de HSA, BSA con F-HSA y F-BSA para determinar la ocurrencia de conjugación. La conjugación fue evidenciada por la movilidad alterada de la Ash-F, ASC-F cuando fue comparada con Ash o ASC respectivamente. Además, el número de grupos libres de amino add presentes en la f-HSA o F-BSA fue determinado por el método de Snyder y Sobocinski (1975) y fue utilizado para evaluar la cantidad de sustitución., El número de grupos amino Unidos al formaldehído fue de 26 para Ash y 31 para ASC. En este cálculo se consideró la formación de reticulación intermolecular.
preparación de conjugados de diisocianato de tolueno-albúmina sérica humana (TDI-HSA) y albúmina sérica bovina (TDI-BSA):
esta preparación fue similar a los métodos de Dewar y Baur (1982). De acuerdo con este método, 1g HSA o 1G BSA se disolvió en 100 ml de una solución tampón que contenía cloruro de potasio (0,05 mol/l), borato de sodio (0,05 mol/l), PH 9,4 y se enfrió a 4 C. dioxano (10 ml) que contenía 0.,A continuación, se agregaron 15 ml de diisocianato de tolueno en gotas mientras se agitaba durante un período de 3 horas, seguido de la adición de 2 ml de etanolamina, centrifugación, filtración por diálisis y liofilización. Similar a F-Ash y F-ASC, la conjugación fue confirmada por electroforesis y determinación de grupos amino libres presentes en el conjugado. El número de grupos amino Unidos a la IDT fue de 37 para Ash y 43 para ASC. Además, el análisis espectrográfico del conjugado se llevó a cabo de acuerdo con Zeiss et. al. (1980)., Hubo un marcado aumento en la absorción de 230 a 260 nm, lo que indicó que la TDI se había unido covalentemente a la proteína transportadora. Este aumento en la absorción estuvo de acuerdo con la determinación del grupo NH2 solo 76% para Ash y 81% para ASC
preparación de anhídrido trimelítico-albúmina sérica humana (TMA-Ash) y anhídrido trimelítico-albúmina sérica bovina (TMA-ASC):
para preparar estos conjugados 25 mg. de MAT se disolvió en 0,5 ml de dioxano y se añadió gota a gota a 25 mg de Ash o ASC disueltos en 5 ml de NaHCO3 frío al 7% en agua., Después de remover durante 60 minutos a 4 C los conjugados fueron dializados contra cuatro cambios de 0.1 m NaHCO3 y un cambio de tampón. Finalmente los conjugados se filtraron y se mantuvieron a -20 C hasta su utilización. Se realizaron análisis de DO de TMA-HSA y TMA-BSA para determinar el número de residuos de TMA vinculados a la proteína portadora correspondiente. La concentración de la proteína transportadora fue convertida a Concentración molar con el peso molecular de la Ash y ASC. A partir de la relación entre la concentración molar del ligando TMA y el portador de proteína, se calculó la relación de residuos de TMA por moléculas de portador., Se estimó que TMA-HSA contenía 5 residuos de TMA por molécula de HSA y para TMA-BSA siete residuos por molécula de albúmina (Pien et al., 1988).
preparación de conjugados de anhídrido ftálico-albúmina sérica humana (PA-HSA) y anhídrido ftálico-albúmina sérica bovina (PA-BSA):
Estos conjugados haptenos se prepararon agregando 75 mg de PA a una solución enfriada de 300 mg de HSA o BSA en 100 ml de H2O. la mezcla de reacción se agitó durante la noche, se dializó contra 0,1 m de PBS utilizando tubos con un corte de 8000 dalton. Usando el método de Zeiss et. al. (1977) se calcularon las relaciones molares., Las relaciones molares fueron de 22/28 para PA / Ash y de 25/30 para PA/ASC.
preparación de conjugados de anillo benceno HSA (B-HSA) y anillo benceno BSA (B-BSA):
para estas preparaciones, 40 mg. de ácido p-aminobenzoico se disolvió en 2 ml de 1 N HCL y se enfrió por inmersión en un baño de hielo. Se añadió una solución fría de 14 mg/ml en gotas. Después de cada adición, la mezcla se agitó durante 30 segundos. En paralelo, se disolvió un gramo de Ash o ASC en ácido bórico 0.16 m cloruro de sodio (0-15 M) tampón PH 9.0 (el PH se elevó con NaOH)., Los vasos de precipitados que contenían las soluciones de albúminas estaban rodeados por un baño de hielo sobre un agitador magnético. La solución de sal de diazonio se añadió gota a gota, con agitación rápida a la solución de proteína fría. Después de la adición de cada gota, el PH se reajustó a 9.0 a 9.5 con un NaOH normal. Cuando se había añadido toda la solución, se permitió que la reacción continuara con agitación lenta durante al menos una hora con adiciones adicionales de solución de NaOH y manteniendo el PH en el rango de 9.0 a 9.5., Las moléculas pequeñas no reaccionadas se eliminaron mediante diálisis extensa o mediante el paso a través de una columna de sephadex G-25 en la cámara fría, con una solución salina isotónica como tampón de elución. Para determinar el número de residuos B vinculados a la proteína portadora correspondiente, se realizaron análisis de Do del desarrollo del color naranja de B-HSA y B-BSA. La cantidad de sustitución B para la Ash fue de aproximadamente 41 y para la ASC de 53 (Migrdichian, 1957).
determinación de anticuerpos:
anticuerpos específicos contra F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA y B-HSA fueron analizados por un ensayo ELISA no competitivo., Los pocillos de las placas de microtiter (Dynatech, Alexandria, VA) se recubrieron con 100 1 de soluciones de antígeno (100 g/ml) en 0.1 M PBS PH 7.2 durante la noche a 4 C. Las placas se lavaron 4 veces con 0.1 M PBS conteniendo 0.05% tween 20 entre cada paso. Los lugares de absorción libre se bloquearon con albúmina sérica bovina libre de proteasa al 2% a temperatura ambiente durante 4 horas y se almacenaron a -20 C hasta su uso.,
procedimiento analítico:
el procedimiento incluyó lo siguiente: (1) lavado cuatro veces, (2) adición de 100 1 de suero diluido (1:2 para IgE y 1:100 para IgM e IgG) en PBS tween-20 con 1% de ASC (3) incubación durante 4 horas a 20 C, seguido de lavado 4 veces, (4) Adición de 100 1 de una dilución óptima de fosfatasa alcalina marcada afinidad 200), IgM (1:500) y anti IgG (1:1000), comprado a KPI (Maryland) (5) incubación durante 120 minutos a 20 C, (6) lavado 6 veces, (7) adición de 100 1 de p-nitrofenil fosfato (Sigma Chemical Co.,) (8) incubación durante 60 minutos a 20 C (9) adición de 50 1 de 3 N solución de hidróxido de sodio, y (10) lectura duplicada. Los resultados se calcularon con base en absorbancias de muestras duplicadas de 405 nm utilizando lector de microtiter. Todas las muestras se compararon con un antígeno de Ash como control de la unión no específica a Ash-F, Ash-TDI, Ash-TMA, Ash-PA y Ash-B. Los resultados se expresaron como título. Titer es la última dilución del suero que da el doble de absorbancia de control de la Ash.,
estudios de especificidad e inhibición cruzada:
para la determinación de la especificidad de anticuerpos se realizó un estudio de inhibición cruzada. Se corrieron sueros positivos para cada conjugado de hapteno-proteína después de la incubación y precipitación adecuadas con incrementos de diez veces mayores de HSA o BSA Unidos a hapteno como inhibidores para cubrir el rango de anticuerpos frente al exceso de antígeno. Este rango estaba entre 50 g a 1000 g para hapten-BSA y 80 g a 1000 g para hapten-RSA., Después de la incubación a 37 C y la eliminación del precipitado por centrifugación, las muestras de antes y después del estudio de inhibición cruzada se colocaron en placas con pozos recubiertos con el conjugado específico. Los pasos posteriores se siguieron como se describió anteriormente para el estudio ELISA.
La Unión de anticuerpos IgG e IgM a diferentes conjugados fue inhibida por hapten-HSA o hapten-BSA del 36-85%. A una concentración dada, tanto hapten-HSA como hapten-BSA inhibieron el nivel de anticuerpos de manera similar.,
se observó inhibición parcial de la Unión de anticuerpos IgE a diferentes conjugados de hapten cuando el suero fue pre-incubado con hapten-Ash o hapten-ASC. Esta observación incompleta de la inhibición de anticuerpos IgE se relacionó principalmente con la no disponibilidad de suero con altos títulos de IgE frente a diferentes sustancias químicas en nuestro laboratorio.,
determinación de los niveles normales de anticuerpos (controles):
Con base en los procedimientos anteriores, se examinaron 160 muestras de donantes de sangre de individuos sanos, de ambos sexos, entre las edades de 22-55, para determinar los niveles de anticuerpos contra F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA y B-HSA. El título promedio fue 1: 800 400 para IgG, 1:3200 1600 para IgM y 1: 8 4 para IgE. Así, en nuestro laboratorio se consideran positivos los títulos superiores a 1:1600 para IgG, 1:6400 para IgM y 1:16 para IgE.,
en un paciente dado, los aumentos o caídas en los títulos de anticuerpos en más de una dilución se consideraron significativos (ver tablas).
enumeración de subconjuntos de linfocitos:
un citómetro de flujo láser único (Epics Profile: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL) que discrimina la dispersión de luz hacia adelante y en ángulo recto, así como dos colores, se utilizó con un paquete de software (Quad Stat: Coulter). Las poblaciones de células mononucleares se determinaron mediante inmunofluorescencia directa de dos colores utilizando una técnica de tinción de sangre completa con el anticuerpo monoclonal apropiado y citometría de flujo (Fletcher et al.,, 1989) se seleccionaron los siguientes pares de anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) (Inmunología Coulter): T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI y T11-FITC/tal-PE para la determinación de células T/células B, T-ayudante/t-supresor, NKHT3+ /nkhy3 y para la vía alternativa de activación de linfocitos respectivamente.
para monitorear los marcadores de linfocitos, se establecieron mapas bat en la población de linfocitos de la dispersión de luz de ángulo delantero versus un histograma de dispersión de luz de 90., Se determinó el porcentaje de células teñidas positivamente para cada par de marcadores, así como el porcentaje de células doblemente teñidas. Las estimaciones del número absoluto de linfocitos positivos para los respectivos marcadores de superficie se determinaron multiplicando el recuento de linfocitos periféricos por el porcentaje de células teñidas positivamente para cada par de marcadores. Además, se determinó el porcentaje de células doblemente teñidas., Las estimaciones del número absoluto de linfocitos positivos para los respectivos marcadores de superficie se determinaron multiplicando el recuento de linfocitos periféricos por el porcentaje de células positivas para cada marcador de superficie.
medición de anticuerpos anti-proteína básica de mielina:
La proteína básica de mielina humana (HMBP) fue preparada por el método de Diebler et al. (1972) y se comprobó su pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamina. El antisuero a HMBP fue inducido en conejos por inyección repetida de HMBP en adyuvante completo de Freund., La actividad de anticuerpos en los sueros de conejo y en las muestras de los pacientes se detectó mediante la adición de diferentes diluciones (1:100 a 1:10.000) de sueros a pocillos de una placa de microtiter previamente recubierta con HMBP de la siguiente manera: hmbp 250 g/ml se disolvió en tampón de carbonato, PH 9,6 y 200 l de esta solución se añadieron a cada pocillo. Después de la incubación, el lavado y el bloqueo como se mencionó anteriormente, se agregaron 200 1 de suero diluido de conejo o humano a los pocillos. Después de la incubación durante una hora a 37 ° C, los sueros se sacaron de los pozos y luego se lavaron 5 veces con solución de lavado., 200 1 de peroxidasa conjugada cabra anti-conejo o cabra anti humano IgG, IgM o IgA (dilución óptima) se añadieron al pocillo apropiado. Después de la incubación y el lavado repetido, se agregaron 200 1 de sustrato ABTS a cada pocillo. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente y se leyeron en un lector de microtiter a una longitud de onda de 405 tun. Se trazó una curva de titulación y se compararon los sueros del paciente con esta curva estándar., Con base en más de 200 controles y determinaciones de muestras de pacientes, se consideraron positivos litros mayores de 1:2000 para IgA, 1:5000 para IgM y 1:8000 para IgG.