Las nucleasas CRISPR/Cas9 se han aplicado ampliamente para la edición del genoma en varios organismos. Cas9 nucleases complexed with a guide RNA (Cas9-gRNA) find their targets by scanning and interrogating the genomic DNA for sequences complementary to the gRNA., El reconocimiento de la secuencia objetivo de ADN requiere un motivo adyacente de protospacer corto (Pam) ubicado fuera de esta secuencia. Dado que la eficiencia de la ubicación del objetivo puede depender de la fuerza de las interacciones que promueven el reconocimiento del objetivo, aquí buscamos comparar afinidades de diferentes nucleasas Cas9 para sus secuencias Pam afines., Con este fin, medimos afinidades de nucleasas Cas9 de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Francisella novicida complejadas con ARN guía (gRNAs) (SpCas9-gRNA, SaCas9-gRNA y FnCas9-gRNA, respectivamente) y de tres variantes de SpCas9-gRNA diseñadas con especificidades Pam alteradas para sondas de ADN cortas que contienen PAM. Utilizamos un ensayo de » baliza «que mide las afinidades relativas de las sondas de ADN determinando su capacidad para afectar competitivamente la tasa de unión de Cas9-gRNA a derivados de ADN blanco marcados fluorescentemente llamados «balizas Cas9».,»Observamos diferencias significativas en las afinidades para secuencias Pam afines entre las enzimas Cas9 estudiadas. Las afinidades relativas de SpCas9-gRNA y sus variantes de ingeniería para PAMs canónicas y subóptimas se correlacionaron con hallazgos previos sobre la eficiencia de estas secuencias PAM en la edición del genoma. Estos hallazgos sugieren que la alta afinidad de una nucleasa Cas9 para su cognado PAM promueve una mayor eficiencia de edición del genoma.