SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida) se usa comúnmente en el laboratorio para la separación de proteínas en función de su peso molecular. Es una de esas técnicas que se usa comúnmente, pero no se entiende completamente con frecuencia. Así que vamos a tratar de arreglar eso.
SDS-PAGE separa las proteínas de acuerdo con su peso molecular, basado en sus tasas diferenciales de migración a través de una matriz de tamizado (un gel) bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado.,
haciendo que la tasa de migración de proteínas sea proporcional al peso Molecular
el movimiento de cualquier especie cargada a través de un campo eléctrico está determinado por su carga neta, su radio molecular y la magnitud del campo aplicado. Pero el problema con las proteínas plegadas de forma nativa es que ni su carga neta ni su radio molecular dependen del peso molecular. En cambio, su carga neta está determinada por la composición de aminoácidos, es decir, la suma de los aminoácidos positivos y negativos en la proteína y el radio molecular por la estructura terciaria de la proteína.,
entonces, en su estado nativo, diferentes proteínas con el mismo peso molecular migrarían a diferentes velocidades en un campo eléctrico dependiendo de su carga y forma 3D.
para separar las proteínas en un campo eléctrico basado únicamente en su peso molecular, necesitamos destruir la estructura terciaria reduciendo la proteína a una molécula Lineal, y de alguna manera enmascarar la carga neta intrínseca de la proteína. Ahí es donde entra el SDS.,
el papel de SDS (et al)
SDS es un detergente que está presente en el tampón de muestra SDS-PAGE donde, junto con un poco de ebullición, y un agente reductor (normalmente TDT o B-ME para descomponer los enlaces disulfuro de proteína-proteína), interrumpe la estructura terciaria de las proteínas. Esto reduce las proteínas plegadas a moléculas lineales.
el SDS también recubre la proteína con una carga negativa uniforme, que enmascara las cargas intrínsecas en los grupos R. El SDS se une de manera bastante uniforme a las proteínas lineales (alrededor de 1.,4G SDS / 1g proteína), lo que significa que la carga de la proteína es ahora aproximadamente proporcional a su peso molecular.
el SDS también está presente en el gel para asegurarse de que una vez que las proteínas están linealizadas y sus cargas enmascaradas, permanezcan así durante toda la carrera.
el factor dominante en la determinación de una proteína recubierta de SDS es su radio molecular., Las proteínas recubiertas de SDS han demostrado ser moléculas lineales, 18 Angstroms de ancho y con longitud proporcional a su peso molecular, por lo que el radio molecular (y por lo tanto su movilidad en el gel) está determinado por el peso molecular de la proteína. Dado que las proteínas recubiertas de SDS tienen la misma relación carga / masa, no habrá migración diferencial basada en la carga.
la matriz de Gel
en un campo eléctrico aplicado, las proteínas tratadas con SDS ahora se moverán hacia el ánodo positivo a diferentes velocidades dependiendo de su peso molecular., Estas diferentes movilidades se exagerarán debido al entorno de alta fricción de una matriz de gel.
como su nombre indica, la matriz de gel utilizada para SDS-PAGE es poliacrilamida, que es una buena opción porque es químicamente inerte y, fundamentalmente, se puede componer fácilmente en una variedad de concentraciones para producir diferentes tamaños de poro dando una variedad de condiciones de separación que se pueden cambiar dependiendo de sus necesidades. Usted puede recordar que anteriormente escribí un artículo sobre el mecanismo de la polimerización de acrilamida.,
el sistema de búfer discontinuo y el gel de apilamiento que los alinea en la línea de salida
para conducir la corriente desde el cátodo (negativo) al ánodo (positivo) a través del gel, obviamente se necesita un búfer. Principalmente utilizamos el sistema de búfer discontinuo Laemmli. «Discontinuo» simplemente significa que el tampón en el gel y el tanque son diferentes.
normalmente, el sistema se configura con un gel apilable a pH 6.8, tamponado por Tris-HCl, un gel en funcionamiento tamponado a pH 8.8 por Tris-HCl y un tampón de electrodos a pH 8.3., El gel de apilamiento tiene una baja concentración de acrilamida y el gel de funcionamiento una mayor concentración capaz de retardar el movimiento de las proteínas.
Así que ¿qué pasa con todos esos diferentes de pH?
bueno, la glicina puede existir en tres estados de carga diferentes, positivo, neutro o negativo, dependiendo del pH. esto se muestra en el siguiente diagrama. El Control del Estado de carga de la glicina por los diferentes tampones es la clave para todo el apilamiento de gel.,
así que así es como funciona el gel de apilamiento. Cuando se enciende la alimentación, los iones de glicina cargados negativamente en el tampón de electrodo de pH 8.3 se ven obligados a ingresar al gel de apilamiento, donde el pH es 6.8. En este ambiente, la glicina cambia predominantemente al estado zwitterionic (neutralmente cargado). Esta pérdida de carga hace que se muevan muy lentamente en el campo eléctrico.
los iones Cl (de Tris-HCl) por otro lado, se mueven mucho más rápidamente en el campo eléctrico y forman un frente iónico que migra por delante de la glicina., La separación de Cl – del contra-ion Tris (que ahora se está moviendo hacia el ánodo) crea una zona estrecha con un gradiente de voltaje empinado que tira de la glicina detrás de ella, lo que resulta en dos frentes estrechamente separados de iones migratorios; el frente Cl – altamente móvil, seguido por el frente de glicina más lento, en su mayoría neutro.,
todas las proteínas en la muestra de gel tienen una movilidad electroforética que es intermedia entre el extremo de la movilidad de la glicina y Cl-, por lo que cuando los dos frentes barren bien a través de la muestra, las proteínas se concentran en la zona estrecha entre los frentes Cl – y glicina.
y están fuera!
esta procesión continúa hasta que golpea el gel en marcha, donde el pH cambia a 8.8. A este pH las moléculas de glicina están cargadas negativamente y pueden migrar mucho más rápido que las proteínas., Así que el frente de glicina acelera más allá de las proteínas, dejándolas en el polvo.
el resultado es que las proteínas se vierten en una banda muy estrecha en la interfaz de los geles de apilamiento y funcionamiento y dado que el gel de funcionamiento tiene una mayor concentración de acrilamida, que ralentiza el movimiento de las proteínas de acuerdo con su tamaño, comienza la separación.
¿de qué se trataba todo eso?
si todavía se pregunta por qué se necesita el gel de apilamiento, piense en lo que pasaría si no lo usa.,
Los Pozos de Gel tienen alrededor de 1 cm de profundidad y generalmente necesita llenarlos sustancialmente para obtener suficiente proteína en el gel. Por lo tanto, en ausencia de un gel apilable, la muestra se colocaría encima del gel de carrera, como una banda de hasta 1 cm de profundidad.
en Lugar de estar alineados juntos y golpear la ejecución de gel juntos, esto significaría que las proteínas en la muestra, podría entrar en la ejecución de gel en diferentes momentos, lo que resulta en muy manchado bandas.,
Por lo que el gel de apilamiento garantiza que todas las proteínas lleguen al gel en funcionamiento al mismo tiempo, por lo que las proteínas del mismo peso molecular migrarán como bandas apretadas.
separación
Una vez que las proteínas están en el gel corriente, se separan porque las proteínas de mayor peso molecular se mueven más lentamente a través del gel de acrilamida porosa que las proteínas de menor peso molecular. El tamaño de los poros en el gel se puede alterar dependiendo del tamaño de las proteínas que desea separar cambiando la concentración de acrilamida. Los valores típicos se muestran a continuación.,
para un rango de separación más amplio, o para proteínas que son difíciles de separar, se puede usar un gel de gradiente, que tiene capas de concentración creciente de acrilamida.