la electroforesis en Gel de ADN es una técnica utilizada para separar e identificar fragmentos de ADN en función del tamaño.
fragmentos de ADN de varios tamaños se cargan en un gel poroso hecho de agarosa, un carbohidrato que se encuentra en las algas rojas.
cuando se aplica un campo eléctrico, los fragmentos migrarán a través del gel, gracias a los grupos fosfato cargados negativamente en los nucleótidos de ADN.
Las piezas más pequeñas de ADN migrarán más fácilmente a través del gel que los fragmentos más grandes, que tienen más dificultades para moverse a través de la matriz del gel.,
cuando se completa el ciclo de gel, la ubicación de las muestras de ADN se puede comparar con una serie de fragmentos o bandas de tamaños conocidos, llamada escalera de ADN.
la presencia de su fragmento de interés se puede confirmar en función de su tamaño, que se determina comparando la ubicación relativa de su muestra de prueba con los fragmentos de la escalera.
Los geles de agarosa se preparan utilizando una solución de porcentaje de peso sobre volumen. Así que 1 gramo de agarosa en 100 ml de tampón hará un gel al 1%., Los geles de porcentaje más bajo resolverán mejor los fragmentos más grandes y los geles de porcentaje más alto harán que los fragmentos más pequeños sean más fáciles de identificar. Para iniciar el procedimiento de fabricación de gel, pesar la masa apropiada de agarosa en un matraz Erlenmeyer.
agregue el búfer en ejecución al matraz, de modo que el volumen del búfer no sea mayor que 1/3 de la capacidad del matraz. Luego agitar para mezclar.
derretir la mezcla de agarosa / tampón calentando en un microondas a máxima potencia. Cada treinta segundos, retirar el matraz y agitar el contenido para mezclar bien. Repetir hasta que la agarosa se haya disuelto por completo.,
a continuación, añadir bromuro de etidio a una concentración de 0,5 mg / ml. El bromuro de etidio es un compuesto aromático que encaja entre pares de bases individuales de ADN, o intercalados, y hace que el ADN emita fluorescencia naranja intensa bajo la luz UV. Es importante tener en cuenta que el bromuro de etidio es un carcinógeno, por lo que siempre se deben usar guantes cuando se manipulen geles que contengan este compuesto.
para evitar que la bandeja de gel se deforme, deje que la agarosa se enfríe colocándola en un baño de agua a 65ºC.
a medida que la agarosa se enfría, prepare el molde de gel colocando la bandeja de gel en el aparato de fundición., Como alternativa, puede usar cinta para sellar los bordes abiertos de la bandeja de gel para crear el molde. Colocar un peine en el gel crea los pocillos donde se carga el ADN. Asegúrese de que el peine creará un pozo que sea del tamaño apropiado para su muestra de ADN.
vierta la agarosa fundida en el molde de gel y deje que se endurezca a temperatura ambiente.
después de que la agarosa se haya endurecido, saque el peine. Si el gel no se va a usar inmediatamente, envuélvalo en una envoltura de plástico y guárdelo a 4ºC hasta su uso.
si el gel se va a usar inmediatamente, colóquelo en la caja de gel.,
Para comenzar este procedimiento, agregue un tinte de carga de gel a las muestras de ADN que se separarán. El tinte de carga se hace típicamente en una concentración 6X. La carga del tinte ayuda a visualizar y cargar las muestras en los pozos y ayuda a determinar hasta qué punto las muestras han migrado durante la operación.
Ajuste la fuente de alimentación a la tensión deseada.
Ahora agregue suficiente búfer de ejecución en la caja de gel para cubrir la superficie del gel. Asegúrese de utilizar el mismo búfer de funcionamiento que el utilizado para preparar el gel.
Conecte los cables de la caja de gel a la fuente de alimentación y enciéndala., Recuerde que el ADN está cargado negativamente y se moverá hacia el ánodo, que es positivo, y generalmente de color rojo. Asegúrese de no conectar el cable negro, o cátodo, a la parte inferior de la caja de gel. Para que no se olvide, tenga en cuenta que los gatos negros son de mala suerte, o negativos, y el cátodo negro es por lo tanto negativo. Pasa tu gel a rojo, o al ánodo. Para verificar que tanto la caja de gel como la fuente de alimentación están funcionando; la aparición de burbujas en los electrodos indica que la corriente está pasando.
Retire la tapa de la caja de gel., Lentamente y con cuidado cargue las muestras de ADN en el gel. Una vez más, el tinte de carga en la muestra permite que la muestra se hunda en el gel y ayudará a rastrear hasta dónde ha viajado la muestra. Siempre se debe cargar un marcador de tamaño de ADN, o escalera, junto con las muestras experimentales.
reemplace la tapa. Compruebe que los electrodos están enchufados en las ranuras correctas de la fuente de alimentación.
Encienda la alimentación. Ejecute el gel hasta que el tinte haya migrado a una distancia adecuada.
Cuando finalice la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire la tapa de la caja de gel.,
retire el gel de la caja de gel y drene el exceso de tampón en la superficie del gel. Coloque la bandeja de gel sobre toallas de papel para absorber cualquier buffer restante.
para visualizar los fragmentos de ADN, retire el gel de la bandeja de gel y exponerlo a la luz ultravioleta.
El fragmento de ADN debe aparecer como bandas fluorescentes naranjas. Toma una foto del gel.
al final del experimento, deseche adecuadamente el gel y el búfer de ejecución según las regulaciones de la institución. Una vez más, Recuerde siempre manejar el gel y los tampones con guantes para evitar la exposición al bromuro de etidio.,
Ahora que has visto cómo realizar electroforesis en gel de ADN. Echemos un vistazo a algunas aplicaciones posteriores y variaciones de este método muy útil.
Aquí puede ver un resultado de electroforesis en gel de agarosa después de separar los productos PCR. Los fragmentos de ADN cargados en el gel son visibles como bandas claramente definidas. El estándar de ADN o escalera debe separarse en un grado que permita la determinación útil de los tamaños de las bandas de muestra. En este ejemplo, fragmentos de ADN de 765 pares de bases, 880 pares de bases y 1022 pares de bases se separan en un 1.,Gel de agarosa al 5% con una escalera de ADN de 2 logs.
además de confirmar la presencia de un fragmento de ADN de interés, la electroforesis en gel de ADN se puede combinar con procedimientos de purificación de gel. Por lo general, una cuchilla de afeitar se utiliza para cortar el fragmento de ADN de interés, para que pueda ser recogido y la muestra de ADN dentro de ella recuperado.,
la electrofesis en gel de agarosa también se puede combinar con transferencia de Transferencia, lo que implica permitir que el ADN, o ARN, se transfiera a una membrana de celulosa donde se pueden usar sondas radiactivas para identificar secuencias específicas de ADN o ARN en su muestra separada electroforéticamente.
la electroforesis en gel de ADN estándar no es ideal para la separación de ADN de alto peso molecular de más de 15-20 kb de tamaño, como el ADN genómico. Para separar muestras grandes de ADN, se usa electroforesis de gel de campo de pulso, que implica someter el gel a un campo eléctrico cambiante o pulsante en diferentes direcciones., Esta técnica consiste en un aparato de gel especializado, que tiene pares de electrodos dispuestos en diferentes orientaciones alrededor del gel. Esto se puede usar para detectar diferencias en el tamaño del genoma entre poblaciones de organismos, como las muestras de ADN agrupadas de diferentes comunidades microbianas, que se toman de diferentes ambientes lacustres.
acabas de ver una introducción a la electroforesis en gel de ADN., Le mostramos el concepto detrás del método, cómo preparar el gel de agarosa, cómo cargar sus muestras, cómo ejecutar el gel y analizarlo y algunas aplicaciones comunes de la electroforesis en gel de agarosa. Gracias por mirar y buena suerte con el funcionamiento de su gel.