escisión de uracilo mediada por UDG y escisión del sitio AP químico en microarrays
La escisión de la cadena de ADN mediada por UDG consiste en dos pasos separados: escisión de la base de uracilo seguida de sitio abasic. Los dos pasos se pueden monitorear por separado en microarrays de ADN., En primer lugar, los sitios abásicos se generan mediante el tratamiento de la matriz con UDG y en un segundo paso, la escisión de la cadena se induce mediante la exposición de los oligonucleótidos de ADN atados a la superficie que contienen los sitios abásicos a condiciones ácidas o básicas, o mediante la evaporación de la superficie a la sequedad. Tales estrategias químicas para escindir sitios abásicos en hebras de ADN eliminan la necesidad de escisión enzimática adicional y permiten que la cinética UDG se estudie de forma independiente., Para este propósito, se diseñaron y sintetizaron matrices de secuencias de ADN de 30MER con un número creciente de incorporaciones de dU no consecutivas (dU1-dU9) mediante fotolitografía de ácido nucleico sin máscara, utilizando la fosforamidita de dU fotosensible correspondiente (Fig. 2). Cada hebra de ADN fue sintetizada con un enlazador dT15 a la superficie del vidrio y terminada en el extremo 5’con una secuencia objetivo de 25mer para hibridación (QC25), como se indica en la Fig. 3.,
Molecular structure of the 5′-NPPOC deoxyuridine 3′-phosphoramidite (in the text referred to as dU or uracil nucleotide.
(A) Sequence design for the investigation of uracil and abasic site cleavage on microarrays., Cada secuencia consiste en un DT15-linker, luego un 30mer sin dUs (control) o un número creciente de incorporaciones de dU (de 1 a 9) reemplazando a dTs en la siguiente secuencia: 5′-TTA CCA TAG AAT CAT GTG CCA TAC ATC ATC-3′. En el extremo 5′, se sintetiza un control 25mer (QC25), que sirve como objetivo para la hibridación de su oligonucleótido complementario marcado con 3′-Cy3 (QC25c). El proceso de escisión se monitorizó mediante el registro de la intensidad de fluorescencia basada en la hibridación antes y después de la escisión mediada por UDG de los nucleótidos de uracilo. (B)small excerpt (ca., 7% del área total de síntesis) de exploraciones de fluorescencia antes y después de la exposición enzimática. Las exploraciones muestran la intensidad de fluorescencia, resultante de la hibridación a un oligonucleótido complementario marcado. Los microarrays fueron escaneados a una resolución de 5 µm. C) disminución de la intensidad de fluorescencia para la escisión de uracilo mediada por UDG (generando así sitios abásicos) en función del número de incorporaciones de nucleótidos de uranio empobrecido por sustrato de ADN. Las eficiencias reales de escisión se correlacionan con la pérdida de intensidad de fluorescencia resultante de la escisión del sustrato de ADN., La matriz se incubó durante una hora con UDG y los sitios abásicos generados fueron posteriormente escindidos en condiciones alcalinas. La disminución de la intensidad de fluorescencia fue registrada y normalizada a la hebra de control (U0). Las intensidades normalizadas, indicadas en unidades arbitrarias, fueron trazadas sobre el número de dhe por sustrato de ADN. Las barras de Error son SD.
la ubicación de todas las secuencias de sonda junto con las réplicas correspondientes y los hilos de control que llevan DT en lugar de nucleótidos de dU se aleatorizó a través de la superficie del microarray., Antes del procesamiento enzimático, las secuencias de la sonda de ADN se hibridaron con el oligonucleótido complementario de 25 ms marcado con Cy3 (QC25c) para determinar los valores iniciales de intensidad de fluorescencia. Se utilizó el etiquetado 3 ‘ – Cy3 para prevenir posibles artefactos de fluorescencia debido a las interacciones del tinte con el número variable de dUs46. Los microarrays fueron expuestos a UDG de origen comercial de E. coli y la escisión del sitio abásico se llevó a cabo posteriormente en diversas condiciones. El tiempo óptimo de exposición enzimática se determinó en los experimentos iniciales. Nuestros resultados (Fig., S1) muestran que después de la adición de la enzima, la eficiencia de escisión aumenta significativamente con el tiempo, hasta una hora, alcanzando una eficiencia de aproximadamente 50-60%, con solo cambios leves tras una mayor exposición a UDG. Por lo tanto, establecemos el tiempo de exposición óptimo en una hora. Además, nuestros datos muestran claramente un aumento de la eficiencia de la escisión con un número creciente de dU, del 40 al 60% (Figs. 3C y S1).
luego pasamos a estudiar el paso real de escisión, la eliminación del sitio abásico después de la escisión de la base de uracilo., Siguiendo las estrategias conocidas para la escisión del sitio abásico inducida químicamente en la solución20, 30, los sitios AP resultantes se dividieron en condiciones alcalinas sumergiendo los conjuntos en una solución 1:1 (v/v) de etilendiamina(EDA)/etanol, o los conjuntos se trataron en condiciones ácidas sumergiéndolos en una solución al 30% (v/v) de ácido tricloroacético en diclorometano, o evaporando la superficie del conjunto a la sequedad. En todos los métodos, los tratamientos se realizaron por diferentes períodos de tiempo, que oscilaron entre 1 y 24 horas., Posteriormente, los arrays fueron recalibrados al oligonucleótido complementario de 25mer marcado con Cy3 (QC25c) y las intensidades de fluorescencia resultantes se compararon con las obtenidas antes del tratamiento con UDG para determinar la eficiencia de escisión. Las tasas de escisión resultantes se indican en la Fig. 4.
Disminución en la intensidad de la fluorescencia después químicamente inducida por un sitio de escisión en sustratos con diferentes número de dU incorporaciones y como una función de tiempo., Las eficiencias de escisión reales se correlacionan con la pérdida de intensidad de fluorescencia, resultante de la escisión del sustrato de ADN. La disminución de la intensidad de fluorescencia fue registrada y normalizada a la de la hebra de control (U0). Las intensidades normalizadas, indicadas en unidades arbitrarias, fueron trazadas a lo largo del tiempo de exposición para los tratamientos químicos. La matriz de ADN se trató en condiciones ácidas( A), alcalinas (B) o evaporando la superficie a sequedad (C) y durante varios tiempos de exposición(1, 2, 4, 8, 12 y 20 horas)., Las hebras de sustrato contenían diferentes proporciones de nucleótidos de dU indicados con diferentes colores: U0 (negro), U1 (rojo), U2 (verde claro), U3 (amarillo), U4 (azul), U5 (rosa), U6 (turquesa), U7 (gris), U8 (rojo oscuro) y U9 (verde oscuro). Las barras de Error son SD.
Bajo condiciones básicas (Fig. 4B), la escisión de los sitios de PA requiere un período mínimo de incubación de 2 horas para poder observar una escisión significativa (40 a 60%) de los sustratos. Sin embargo, tratar la matriz con un ácido o secar su superficie (Fig., 4A, C, respectivamente) resulta en una escisión clara y extensa después de solo una hora (30 a casi 80% con un tratamiento ácido), cuando la escisión del sitio abásico mediada por EDA es mínima después de una hora. Es probable que la reacción de escisión en sí misma en los métodos A y C se promueva en la etapa final de hibridación, ya sea debido a la temperatura o a la presencia de una amina en el tampón., Sin embargo, dado que la hibridación es común a los tres métodos, las grandes diferencias en la cinética de escisión entre los tratamientos básicos y no básicos sugieren la posibilidad de que se produzcan sitios adicionales de AP en presencia de un ácido, o bajo presión reducida, produciendo posiciones adicionales en las hebras de ADN en las que puede ocurrir una reacción de escisión posterior. Los tratamientos más largos, independientemente del método, no cambian significativamente el grado de escisión, generalmente acercándose al 40% al 80% dependiendo del número de incorporaciones de dU., De hecho, vemos un claro aumento general en la eficiencia de la escisión con un número creciente de incorporaciones de dU, en todas las condiciones probadas.
además de realizar la escisión de la cadena de ADN inducida químicamente en las ubicaciones del sitio abasic, se examinó la calidad de la superficie del microarray. Para este propósito, se inspeccionó visualmente la uniformidad de las características en las superficies de la matriz en función de las intensidades de fluorescencia y se monitoreó la pérdida de fluorescencia para los hilos de control no clivables., Encontramos que la escisión del sitio abásico bajo condiciones alcalinas permitió una escisión específica mediada por enzimas de secuencias que contienen uranio empobrecido, pero dejó las secuencias de control prácticamente intactas, mientras que en condiciones ácidas, también se observó la escisión de las hebras de ADN para las hebras de control que carecen de nucleótidos de uracilo (Fig. S2). El secado de la superficie también llevó a la degradación de los hilos de control solo dT. Dado que solo la escisión del sitio abásico en condiciones alcalinas evita la degradación de la superficie y la pérdida no específica de ADN, realizamos todos los experimentos posteriores en estas Condiciones., Esto garantiza que las secuencias de control no disociables permanezcan disponibles para la comparación incluso después de un tratamiento químico prolongado.
dependencia de secuencias UDG monocatenarias y bicatenarias
dado que nuestros resultados en la escisión de dU mediada por UDG de E. coli solo proporcionaron eficiencias de escisión moderadas para hebras de ADN que contienen incorporaciones de dU simples (≈40%), interrogamos la especificidad de secuencia de UDG con el fin de identificar potencialmente un sustrato que contiene dU altamente escindido. Para este propósito, diseñamos una biblioteca de ácidos nucleicos que contiene uranio empobrecido a partir de secuencias de ADN de doble y monocatenario., La biblioteca consiste en una secuencia permutable de 7mer con un solo dU en el medio (Fig. 5). La permutación de las regiones flanqueantes 3-nt, 5′ – así como 3 ‘ del dU da como resultado 4096 secuencias únicas. En el formato de doble cadena, se agregó un bucle y la secuencia complementaria al 7mer, lo que llevó a la formación de una estructura de horquilla. Los pares de bases adicionales dG·dC en el vástago de la horquilla ayudaron a aumentar la temperatura de fusión de la estructura del ADN de la horquilla. Estos pares de bases se añadieron a los sustratos monocatenarios con el fin de mantener los diseños de ssDNA y dsDNA lo más similares posible., Finalmente, se añadió un oligonucleótido de 25mer al final de 5’de cada diseño para servir como objetivo de hibridación. Una figura representativa de los diseños de secuencia se muestra en la Fig. 5.
ilustración Esquemática de la secuencia de diseño para la investigación de E. coli UDG secuencia de las dependencias de la único (A) y de doble cadena de ADN de los sustratos., (B) in order to investigate the UDG sequence dependence, a single dU is incorporated into a DNA strand and enclosed by 3 permuted bases on each side. A el diseño para el estudio de la dependencia de la secuencia UDG en sustratos de ADN monocatenario consiste en un DT-linker de 15mer, un solo dU encerrado por 3 bases permutadas en cada lado, seguido de una secuencia de 5′ 25mer (QC25) que sirve como objetivo para la hibridación de su oligonucleótido complementario marcado con 3′-Cy3 (QC25c). B Para el estudio de la dependencia de la secuencia UDG en sustratos de ADN de doble cadena, las secuencias se diseñaron para formar un bucle de horquilla., Los hilos resultantes consistieron en un DT-linker de 15mer, un tallo de 11-nt, equivalente al diseño de una sola cadena, que contiene la región variable flanqueada por pares de bases dG·dC, un bucle de 4-nt seguido de la cadena complementaria 11nt. En el extremo 5′, se sintetizó una secuencia de blanco hibridable de 25mer (QC25).,
aunque el etiquetado terminal de ADN con un tinte fluorescente es un método conveniente para medir directamente la intensidad de fluorescencia, tiene la desventaja de un ruido de fluorescencia alto que, especialmente en microarrays de alta densidad, dificulta la extracción e interpretación de datos. Por lo tanto, decidimos monitorear la reacción de escisión a través de la hibridación a las secuencias inmovilizadas., Antes del tratamiento con UDG, los sustratos de ADN monocatenario y bicatenario se hibridaron con el oligonucleótido complementario marcado de 25mer y se escanearon para obtener los valores iniciales de fluorescencia. Luego, los microarrays fueron expuestos a UDG por diferentes períodos de tiempo. Después de la siguiente escisión del sitio AP en condiciones alcalinas, las matrices se hibridaron nuevamente con sus complementos marcados con Cy3. La disminución de la señal de fluorescencia de las hebras de ADN en relación con los valores de fluorescencia pretratamiento corresponde directamente a la eficiencia de escisión., Se obtuvieron eficiencias de escisión máximas de alrededor del 40% para sustratos de doble hebra después de la incubación de UDG durante 2 minutos, y tasas de escisión ligeramente inferiores para sustratos de una sola hebra (tabla S1). Esta tasa más baja para los monocatenarios contradice estudios anteriores que indican que se escinden más rápido que sus equivalentes bicatenarios13,47,48. Curiosamente, las incubaciones enzimáticas muy cortas (< 1 min) todavía conducen a eficiencias de escisión significativas (30-35%)., Estos puntos de tiempo cortos son especialmente interesantes, ya que dan pistas claras de las preferencias de secuencia potenciales. Con el fin de identificar la dependencia de la secuencia en la degradación del ADN mediada por UDG de nuestro conjunto de 4096 hebras individuales, nos centramos en el 1% (Fig. 6)así como el 5% (Fig. S3) del subconjunto más y menos escindido de secuencias. Los motivos de secuencia representativos generados a partir de esos subconjuntos de secuencia se muestran en la Fig. 6 y en la Información Complementaria.,
motivos de secuencia representativos para la escisión de uracilo mediada por UDG en hebras de ADN doble (A,B) y monocatenario (C,D). Los sustratos se incubaron con UDG durante diferentes períodos de tiempo que iban de 5 segundos a 30 minutos (ya que los motivos de escisión mostraron poca o ninguna dependencia de la secuencia, solo se determinaron los 5s, 30s, 60s y 120s para ssDNA)., Los motivos de secuencia se extrajeron de las secuencias más hendidas (A,C) y menos hendidas (B,D) del 1% (41 de 4096 secuencias) de la biblioteca.
Por ADN de doble cadena (Fig. 6A, B), los resultados muestran una clara preferencia de secuencia UDG para regiones ricas en G/C que flanquean el uracilo. Por el contrario, la UDG parece procesar mal sustratos de doble cadena que contienen pares de bases T * A. Los motivos extraídos de sustratos de UDG mejores y más pobres están parcialmente de acuerdo con los muy limitados datos de la literatura existente48,49,50. Seibert et al., se planteó la hipótesis de que la eficiencia de E. coli UDG está relacionada con el costo energético de la flexión y distorsión del ADN que ocurre en el proceso de reconocimiento de daños específicos. En simulaciones de dinámica molecular y experimentos de fluorescencia con resolución temporal con dos secuencias de ADN de doble cadena que contienen uracilo, identificaron que las constantes de fuerza de flexión efectiva son menores si dAs o dTs se encuentran adyacentes al nucleótido de uracilo, en lugar de dGs y dCs; lo que sugiere que las secuencias ricas en dA/dT podrían doblarse más fácilmente por UDG y, por lo tanto, procesarse mejor49., Dado que el ADN monocatenario es una forma de ADN mucho más flexible, su procesamiento más rápido reportado en la literatura podría deberse al menor costo energético de la escisión de sustratos que son inherentemente más flexibles que el dsDNA7,47,49,51. Sin embargo, la flexión puede no ser un factor decisivo en la especificidad de escisión de UDG del adnss, con la enzima reconociendo y escindiendo todos los sustratos igualmente bien, lo que tal vez explique la ausencia de consenso de secuencia en el adnss que contiene dU., Sin embargo, se planteó la hipótesis de que los efectos del contexto de la secuencia todavía se extienden al ADN monocatenario, y de hecho se habían observado para la UDG del virus del herpes simple tipo 152, pero todavía no está claro para la UDG humana o E. coli. Slupphaug et al. se midió la especificidad de secuencia de la UDG humana en 34 contextos de secuencia de dsDNA y se conjeturó que el dT 3 ‘ a dU siempre resulta en una eliminación lenta, al igual que, de manera algo discordante, un alto contenido de GC 50. Eftedal et al. se evaluó la eficiencia de escisión tanto del timo de ternero como de E. coli UDG a partir de 41 secuencias de dsDNA y se encontró un patrón similar., Con nuestro conjunto mucho más grande de secuencias, podemos estar de acuerdo en que dT 3′ a dU siempre resulta en una eliminación lenta, pero nuestros datos muestran claramente que dC, y dG en menor medida, 3’ a dU resulta en una eliminación rápida. No pudimos identificar una dependencia significativa de la secuencia para la escisión del dU en el adnss (Fig. 6C, D). Cabe señalar que la dependencia de la secuencia en sustratos de dsDNA es clara para tratamientos enzimáticos cortos (5s, 30s, 60s y 120s), pero se desvanece lentamente para una exposición más larga a UDG (30min), lo que indica que todos los sustratos finalmente se rompen cuando se exponen a la enzima.,
optimizaciones del sitio de escisión
dado que de nuestros estudios no surgió ninguna dependencia significativa de secuencia para la escisión de uracilo mediada por UDG en ADN monocatenario y se obtuvieron eficiencias de escisión bastante moderadas para incorporaciones de dU simples, optamos por estudiar la escisión de dU mediada por UDG en sustratos monocatenarios Más largos que contienen varias formas de incorporaciones de dU múltiples, con el objetivo de identificar sitios de escisión específicos que sean fácilmente enzimáticamente accesibles y permitan una escisión de hebras rápida y eficiente., Nuestra razón de ser es que el aumento de la distancia de la sonda desde la superficie debe proporcionar una mayor accesibilidad para la escisión, pero este efecto no puede transferirse a espaciadores largos (>20-nt)53. Basado en los resultados de la Fig. 3, también esperamos que un mayor número de incorporaciones de dU conduzca a una mayor escisión general, pero nos preguntamos si hay una densidad óptima de nucleótidos de dU dentro de la sección escindible de la cadena de ADN. Por lo tanto, investigamos la escisión de uracilo en homopolímeros de dU Más largos (10, 15 y 20 m), así como en oligómeros con una composición de dU variable en%., El porcentaje de dU dentro del oligómero se calculó en relación con los otros cuatro nucleótidos (dA, dC, dG y dT) y se logró experimentalmente mediante la realización de reacciones de acoplamiento con soluciones premezcladas de fosforamiditos dU/dA/dC/dG/dT en varias proporciones (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 o 100:0, (V / v) dU: dA / dC / dG / dT). Las secuencias, construidas sobre enlazadores poly-dT de longitudes variables (dT1, dT5, dT10 y dT15), y la región que contiene dU fueron terminadas con una secuencia objetivo de 25mer para propósitos de hibridación como se indica en la Fig. 7.,
La escisión de la eficiencia de una sola cadena de sustratos de la UDG o USUARIO de las enzimas. Se están investigando tres parámetros: longitud del enlazador (en azul), Longitud del segmento que contiene dU (10, 15 o 20 nt de largo en negro, gris y gris claro, respectivamente) y contenido de dU (de 0 a 100%, en el eje x). Todos los sustratos se terminan en el extremo 5ʹ con una secuencia hibridable de 25mer., Los microarrays correspondientes fueron tratados con UDG o enzima usuaria (5 U, 1 h a 37 ° C) y posteriormente, en el caso del tratamiento UDG, con EDA/EtOH durante 2 h a la T. r.la eficiencia de escisión corresponde a la pérdida de fluorescencia de hibridación después del tratamiento enzimático y relativa al 0% de controles de dU.
después de la síntesis, el 25mer se hibridó a su oligonucleótido complementario marcado con 5′-Cy3 y el microarray se expuso a UDG durante 1 hora., Luego, se realizó la escisión del sitio abásico en condiciones alcalinas, seguida de una rehibridización final. En paralelo, también realizamos el ensayo de escisión con la enzima usuaria, lo que en este caso elimina la necesidad de un procedimiento adicional de escisión del sitio abásico.
para el ensayo enzimático con UDG seguido de escisión del sitio abásico en condiciones alcalinas (Fig. 7, izquierda), registramos eficiencias de escisión que van desde el 4% hasta el 80% y con tendencias claras emergentes., Por ejemplo, la eficiencia de escisión aumenta significativamente con el aumento de la longitud de la región que contiene dU, en el orden 10mer > 15mer > 20mer, con un máximo de ~50% de escisión alcanzable para una región de 10mer dU, y 80% máximo para la región de 20mer dU. Del mismo modo, los enlazadores Más largos resultan en una tasa general de escisión más alta. Estas observaciones indican que las secuencias más largas son mejor reconocidas y las bases de uracilo correspondientes mejor extirpadas por UDG, lo que a su vez sugiere una mayor accesibilidad de los sustratos más largos por la enzima., La eficiencia de escisión también se ve afectada por la cantidad de nucleótidos de dU dentro de la parte escindible del sustrato. De hecho, los homopolímeros de uracilo (100% dU) son casi siempre menos hendidos que sus congéneres con nucleótidos de dU intercalados, y este efecto es particularmente claro cuando los sustratos se sintetizan sobre un enlazador T1 corto. Por otro lado, el aumento del contenido de dU del 12 al 50% se cumple con el aumento de la eficiencia de escisión, con un 50% de dU que parece ser la cantidad óptima., Por lo tanto, bajo nuestras condiciones experimentales, la escisión mediada por UDG fue la más eficiente en los sustratos más largos donde la mitad de los nucleótidos en la parte clivable son dU (eficiencia de escisión del 80%). Esta tendencia, así como los datos que se muestran en la Fig. 3, sugiere que la UDG puede reconocer y unirse a múltiples incorporaciones de dU, siempre y cuando la du esté separada por nucleótidos canónicos de ADN.
mientras que los homopolímeros cortos son generalmente conocidos por ser sustratos UDG pobres, también esperamos observar tasas de escisión bajas para las regiones clivables de 20 metros ya que es poco probable que tales sustratos se encuentren en el ADN., In vivo, las bases de uracilo ocurren principalmente en las hebras de ADN debido a la incorporación errónea durante la replicación o debido a la desaminación8,9 y es poco probable que ambos procesos ocurran a una frecuencia tan alta para formar homopolímeros. Sin embargo, se obtuvieron eficiencias de escisión moderadas a altas de alrededor del 60% en homopolímeros de dU de 20 m de largo, pero queda por investigar si esos homopolímeros se procesan más lentamente que los sustratos con menor contenido de dU.
tratar una biblioteca de matriz de ADN similar con el sistema enzimático del usuario (Fig., 7, derecha) conduce a una escisión satisfactoria de sustratos monocatenarios, con tendencias de escisión algo comparables a las del caso UDG, pero con algunas excepciones notables. En primer lugar, la mayor eficiencia de escisión es menor que para el sistema UDG/EDA (55% versus 80%, respectivamente), lo que puede atribuirse a un procesamiento más lento de los sitios abásicos con endonucleasa VIII en comparación con un tratamiento básico común con EDA., En segundo lugar, parece haber una discriminación de longitud más débil en la región escindible en comparación con UDG/EDA, con solo una diferencia del 20-25% como máximo entre las regiones que contienen dU cortas (10-TN) y largas (20-TN), cuando el tratamiento con UDG solo condujo a grandes variaciones en la eficiencia de escisión de los mismos 10 y 20 m (hasta una diferencia del 50%). Una vez más, este efecto podría deberse a las diferencias en la tasa de procesamiento de los sitios AP. Finalmente, los homopolímeros de dU parecen degradarse en la misma medida, independientemente de la longitud del enlazador o del sustrato., Esta falta de discriminación en el caso de la enzima usuaria y en comparación con los datos de escisión mediada por UDG sugiere que la existencia de múltiples sitios de PA consecutivos es el factor limitante en la eliminación enzimática de los sitios de PA.
para resumir, en nuestras manos, encontramos que las mejores eficiencias de escisión se pueden lograr con la escisión mediada por UDG seguida de un tratamiento de EDA en sustratos más largos, no homopoliméricos que contienen uracilo. Al hacerlo, las secuencias monocatenarias que contienen un 50% de dU se pueden dividir de manera eficiente, aunque en dos pasos., Un tratamiento corto de un solo paso con el cóctel enzimático del usuario también puede dividir convenientemente hasta el 50% de las hebras individuales que contienen dU en una hora, sin embargo, el poder discriminador aparentemente menor de este tratamiento enzimático particular puede ser menos útil cuando se requiere una escisión preferencial.