¿Qué es la citometría de flujo (análisis FACS)?

desarrollado originalmente a finales de la década de 1960, la citometría de flujo es una técnica analítica popular de biología celular que utiliza la luz para contar y perfilar células en una mezcla de fluidos heterogénea. La citometría de flujo es un método particularmente poderoso porque permite a un investigador recopilar datos relacionados con muchos parámetros de una mezcla de fluidos heterogénea que contiene células vivas de forma rápida, precisa y sencilla.,

la citometría de flujo se utiliza ampliamente en las ciencias biomédicas y de la vida, y se puede aplicar en cualquier escenario en el que un investigador necesite perfilar rápidamente una gran población de células sueltas en un medio líquido. Por ejemplo, en inmunología, la citometría de flujo se utiliza para identificar, separar y caracterizar varios subtipos de células inmunitarias en virtud de su tamaño y morfología.

cuando se requiere información adicional, anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes, y levantados contra antígenos de superficie celular altamente específicos (p. ej., grupos de diferenciación o CD mp) puede ser utilizado para identificar y segregar a los específicos de la sub-poblaciones dentro de un grupo más grande.

en un citómetro de flujo

• Las células de muestra se pasan a través de un canal estrecho una a la vez.
• La Luz se utiliza para iluminar las células en el canal.
• Una serie de sensores detectan los tipos de luz refractada o emitida por las células.
• Los datos adquiridos por los sensores se compilan e integran para construir una imagen completa de la muestra.,

FACS Anticuerpos utilizados actualmente para la Investigación

Diferentes Tipos de Luz utilizada en una de Citometría de Flujo Experimento

Un citómetro de flujo utiliza refractada o luz emitida para identificar y contar las células. Aprenda sobre los diferentes tipos de luz utilizados en un experimento de citometría de flujo en las siguientes figuras.,

dispersión hacia adelante

La luz dispersa hacia adelante es refractada por una celda en el canal de flujo y continúa en la trayectoria de la luz (es decir, en la misma dirección en que la luz viajaba originalmente). La luz dispersa hacia adelante es detectada por un sensor en la trayectoria de la luz, y se utiliza típicamente para identificar el tamaño de partícula.

La luz dispersa hacia adelante se usa más comúnmente para detectar el tamaño del objeto en la trayectoria de la luz., Los objetos más grandes producirán más luz dispersa hacia adelante que los objetos más pequeños, y las celdas más grandes tendrán una señal de dispersión hacia adelante más fuerte

dispersión lateral

luz dispersa lateral la luz pasa de la fuente de iluminación al canal de flujo, una dirección que está fuera del camino de la luz original. La luz dispersa lateral es detectada por un sensor que es ortogonal a la trayectoria de luz original.,

La luz dispersa lateral se utiliza generalmente para hacer una determinación con respecto a la granularidad y complejidad de la célula en la trayectoria de la luz. Las células altamente granulares con una gran cantidad de complejidad interna, como los neutrófilos, producirán más luz dispersa lateral y una señal de dispersión lateral más alta que las células con una baja granularidad y complejidad.

emisión de fluorescencia

la luz fluorescente es emitida por moléculas fluorescentes después de la excitación por un láser de longitud de onda compatible., La luz fluorescente puede originarse de materiales fluorescentes naturales en la célula, o puede originarse de tintes fluorescentes o anticuerpos marcados con fluorescencia que se han utilizado para etiquetar una estructura específica en la célula.

análisis multiparamétrico

Un diagrama de puntos de citometría de flujo simulado, trazando hacia adelante vs lado dispersado de una población de leucocitos., Las poblaciones celulares están marcadas por su probable identidad:

D presuntos restos, elementos muy pequeños con baja baja dispersión hacia adelante y hacia los lados.

L/M leucocitos / monocitos probables, células pequeñas a medianas con baja complejidad/granularidad interna. Estas células generan una intensidad de señal media de dispersión hacia adelante y baja de dispersión lateral

G probables granulocitos, células grandes con alta complejidad/granularidad interna. Estas células generan altas señales de dispersión hacia adelante y hacia los lados.,

mientras que algunas identidades pueden ser confirmadas por perfiles de dispersión hacia adelante y hacia los lados, el etiquetado con un marcador específico del tipo de célula siempre proporciona una mayor resolución y certeza al perfilar poblaciones heterogéneas complejas de células.

por ejemplo, en la gráfica anterior, un investigador puede ser capaz de distinguir entre granulocitos y linfocitos utilizando luz dispersa hacia adelante y hacia los lados. Sin embargo, tres clases de granulocitos (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) son muy similares en tamaño y estructura, lo que les da propiedades similares de dispersión de la luz., En este caso, los neutrófilos podrían ser etiquetados selectivamente en virtud de su expresión un marcador específico de neutrófilos como Elane.

FACS: clasificación de células basadas en datos de citometría de flujo

los Términos citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) a menudo se usan indistintamente. En la práctica, hay diferencias entre los dos métodos.

FACS es un derivado de la citometría de flujo que añade un grado excepcional de funcionalidad. Usando FACS un investigador puede ordenar físicamente una mezcla heterogénea de células en diferentes poblaciones.,

mediante el uso de anticuerpos altamente específicos Etiquetados con tintes fluorescentes, un investigador puede realizar análisis FACS y simultáneamente recopilar datos sobre, y clasificar una muestra por un número casi ilimitado de diferentes parámetros.

en un experimento FACS:

• se recopilan datos de dispersión frontal, dispersión lateral y fluorescente, como en la citometría de flujo convencional.
• Los parámetros definidos por el usuario proporcionan información sobre cómo se deben ordenar las celdas.
• Sobre la base de estos parámetros, la máquina FACS utiliza un electrodo para imponer una carga eléctrica en cada célula.,
• Al salir de la cámara de flujo, los electroimanes clasificarán las celdas por carga en recipientes separados.

¿qué aspecto tienen los datos de citometría de flujo?

en un experimento de citometría de flujo, cada célula que pasa a través del citómetro de flujo y se detecta se clasificará como un evento distinto.

además, a cada tipo de luz que es detectada por el citómetro de flujo (dispersión frontal, dispersión lateral y cada longitud de onda de emisión de fluorescencia) se le asignará su propio canal único., Los datos de la citometría de flujo trazarán cada evento de forma independiente y representarán la intensidad de la señal de luz detectada en cada canal para cada evento.

los datos de citometría de flujo se representan típicamente de una de dos maneras: histogramas, que miden o comparan solo un parámetro, y gráficos de puntos que comparan 2 o 3 parámetros simultáneamente en un diagrama de dispersión bidimensional o tridimensional.

un histograma típicamente traza la intensidad detectada en un solo canal a lo largo de un eje y el número de eventos detectados a esa intensidad está en un eje separado., Un gran número de eventos detectados a una intensidad particular se mostrarán como un pico en el histograma.

por el contrario, en un gráfico de puntos, cada evento se representa como un solo punto en un gráfico de dispersión. La intensidad de 2 canales diferentes (o 3 canales diferentes en una gráfica tridimensional) se representa a lo largo de los diversos ejes. Los eventos con intensidades similares se agruparán en la misma región en el gráfico de dispersión.

los histogramas y los gráficos de puntos proporcionan diferentes ventajas para el análisis de datos de citometría de flujo. Elegir la mejor manera de representar sus datos puede ayudar a garantizar que cuenten una historia completa en un formato simple y comprensible.

Las gráficas de puntos y los histogramas no son mutuamente excluyentes, y la mayoría de los experimentos complejos de citometría de flujo harán uso de múltiples gráficas para mostrar datos ricos y multiparamétricos en una muestra.

en muchos casos, se deben trazar simultáneamente más de tres parámetros., En este caso, una técnica de análisis de datos conocida como gating puede ayudar a dar una resolución y flexibilidad adicionales, permitiendo el análisis de una cantidad casi ilimitada de parámetros simultáneamente a través de varios gráficos de dispersión e histogramas diferentes.

Gating agrega resolución a los datos de citometría de flujo

En resumen, gating es un método para seleccionar células de un experimento de citometría de flujo que desea analizar con más detalle específico., El Gating permite a un investigador reunir y mostrar más información sobre una subpoblación de células de la que normalmente se podría mostrar en una gráfica de puntos de 2 o 3 dimensiones.

Gating añade resolución a un experimento de citometría de flujo, y permite el análisis simultáneo de un número casi ilimitado de diferentes parámetros (canales).

en un experimento de citometría de flujo cerrada:

• Un usuario recopila datos de citometría de flujo de uno o más canales en un gráfico de puntos.
• basado en los datos adquiridos, el usuario dibuja una caja de puerta seleccionando una subpoblación de células para un análisis posterior.,
• la subpoblación de celdas dentro de la puerta se resaltará específicamente en otras gráficas que muestran información de canales alternativos.

Las puertas agregan una increíble cantidad de flexibilidad a la citometría de flujo, otorgando hasta una resolución unicelular para cada canal disponible para el investigador. Se pueden establecer múltiples compuertas para un solo diagrama de dispersión, y las compuertas se pueden «apilar» y combinar (es decir, una subpoblación de celdas cerradas para los canales 1 y 2 se puede cerrar aún más para los canales 3 y 4 para permitir una mayor especificidad y un análisis más profundo).,

Un ejemplo de la compuerta

Una nota sobre la Compensación

el Desbordamiento de un canal a otro puede causar falsamente como positivos se identificaron las señales. Spillover es la señal artefacto que un tinte fluorescente puede causar en el canal de otro fluoróforo en función de su brillo relativo y espectro de emisión. Aquí es donde la compensación entra en juego. La compensación es un procedimiento que aísla la señal de un canal en particular de los otros canales utilizados en el mismo experimento. FITC E. G., tiene su pico de emisión en el rango verde del espectro electromagnético. Sin embargo, también fluorescente en el canal amarillo donde el PE emite luz. En pocas palabras, la compensación resta la señal FITC del canal PE.

esta señal en el canal «incorrecto» se resta de la señal causada por el fluoróforo de interés. En la muestra anterior, la relación de los componentes verde y amarillo en una longitud de onda de excitación dada es constante para FITC., Por lo tanto, es posible inferir la cantidad de señal FITC amarilla no específica en el canal PE a partir de la medición en el canal verde utilizando los coeficientes de compensación constante. Lo mismo es cierto para el derrame del PE en el canal FITC.