L’électrophorèse sur Gel d’ADN est une technique utilisée pour séparer et identifier les fragments d’ADN en fonction de leur taille.
des fragments D’ADN de différentes tailles sont chargés dans un gel poreux à base d’agarose – un glucide présent dans les algues rouges.
lorsqu’un champ électrique est appliqué, les fragments migrent à travers le gel, grâce aux groupes phosphates chargés négativement dans les nucléotides D’ADN.
de plus petits morceaux d’ADN migrent plus facilement à travers le gel que de plus gros fragments, qui ont plus de difficulté à se déplacer à travers la matrice du gel.,
lorsque le cycle de gel est terminé, l’emplacement de vos échantillons D’ADN peut être comparé à une série de fragments ou de bandes de tailles connues, appelées échelle D’ADN.
la présence de votre fragment d’intérêt peut alors être confirmée en fonction de sa taille, qui est déterminée en comparant l’emplacement relatif de votre échantillon de test aux fragments de l’échelle.
Les gels D’Agarose sont préparés à l’aide d’une solution en pourcentage poids sur volume. Donc 1 g d’agarose dans 100 ml de tampon 1% gel., Des gels à faible pourcentage résoudront mieux les fragments plus gros et des gels à pourcentage plus élevé rendront les fragments plus petits plus faciles à identifier. Pour commencer la procédure de fabrication du gel, peser la masse appropriée d’agarose dans un flacon Erlenmeyer.
ajoutez le tampon courant au ballon, de sorte que le volume du tampon ne soit pas supérieur à 1/3 de la capacité du ballon. Puis tourbillonner pour mélanger.
faire fondre le mélange agarose / tampon en chauffant au micro-ondes à puissance maximale. Toutes les trente secondes, retirez le flacon et agitez le contenu pour bien mélanger. Répétez jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.,
ajouter ensuite le bromure d’éthidium à une concentration de 0,5 mg/ml. Le bromure d’éthidium est un composé aromatique qui s’insère entre les paires de bases individuelles d’ADN, ou intercalate, et provoque L’émission d’une fluorescence orange intense sous la lumière UV. Il est important de noter que le bromure d’éthidium est un cancérigène, de sorte que des gants doivent toujours être portés lors de la manipulation de gels contenant ce composé.
pour éviter que le plateau de gel ne se déforme, laissez l’agarose refroidir en la plaçant dans un bain d’eau à 65ºC.
pendant que l’agarose refroidit, préparez le moule de gel en plaçant le plateau de gel dans l’appareil de coulée., Comme alternative, vous pouvez utiliser du ruban adhésif pour sceller les bords ouverts du gel plateau pour créer le moule. Placer un peigne dans le gel crée les puits où L’ADN est chargé. Assurez-vous que le peigne créera un puits de la taille appropriée pour votre échantillon D’ADN.
verser l’agarose fondue dans le moule de gel et laisser durcir à température ambiante.
Après que l’agarose a durci, sortez le peigne. Si le gel ne doit pas être utilisé immédiatement, enveloppez-le dans une pellicule plastique et conservez-le à 4ºC jusqu’à son utilisation.
si le gel doit être utilisé immédiatement, placez-le dans la boîte de gel.,
pour commencer cette procédure, ajoutez un colorant chargé de gel aux échantillons D’ADN à séparer. Le colorant de chargement est généralement fabriqué à une concentration de 6X. Le colorant de chargement aide à visualiser et à charger des échantillons dans les puits et aide à déterminer dans quelle mesure les échantillons ont migré pendant la course.
réglez l’alimentation sur la tension souhaitée.
ajoutez maintenant suffisamment de tampon courant dans la boîte de gel pour couvrir la surface du gel. Assurez-vous d’utiliser le même tampon que celui utilisé pour préparer le gel.
Connectez les fils de la boîte de gel pour l’alimentation et allumez-le., Rappelez-vous que L’ADN est chargé négativement et se déplacera vers l’anode, qui est positive, et généralement de couleur rouge. Assurez-vous de ne pas connecter le fil noir, ou la cathode, au fond de la boîte de gel. Donc, n’oubliez pas, gardez à l’esprit que les chats noirs sont de la malchance, ou négatifs, et la CAThode Noire est donc négative. Passez votre gel au rouge ou à l’anode. Pour vérifier que la boîte de gel et l’alimentation fonctionnent; l’apparition de bulles au niveau des électrodes indique que le courant traverse.
Retirez le couvercle de la boîte de gel., Chargez lentement et soigneusement les échantillons D’ADN dans le gel. Encore une fois, le colorant de chargement dans l’échantillon permet à l’échantillon de s’enfoncer dans le gel et aidera à suivre la distance parcourue par l’échantillon. Un marqueur de taille D’ADN, ou échelle, doit toujours être chargé avec les échantillons expérimentaux.
Remplacer le couvercle. Vérifiez que les électrodes sont branchées dans les fentes appropriées dans l’alimentation.
allumez l’appareil. Exécutez le gel jusqu’à ce que le colorant ait migré à une distance appropriée.
lorsque l’électrophorèse est terminée, coupez l’alimentation et retirez le couvercle de la boîte de gel.,
retirez le gel de la boîte de gel et égouttez l’excès de tampon sur la surface du gel. Placez le plateau de gel sur des serviettes en papier pour absorber tout tampon restant.
pour visualiser les fragments D’ADN, retirez le gel du plateau de gel et exposez le gel à la lumière ultraviolette.
Les fragments D’ADN doivent apparaître sous forme de bandes fluorescentes orange. Prenez une photo du gel.
à la fin de l’expérience, éliminer correctement le gel et le tampon de fonctionnement conformément aux règlements de l’établissement. Encore une fois, n’oubliez pas de toujours manipuler le gel et les tampons de course avec des gants pour éviter l’exposition au bromure d’éthidium.,
maintenant que vous avez vu comment effectuer l’électrophorèse sur GEL D’ADN. Jetons un coup d’œil à certaines applications en aval et variantes de cette méthode très utile.
Vous voyez ici un résultat d’électrophorèse sur gel d’agarose après séparation des produits PCR. Les fragments D’ADN chargés dans le gel sont visibles sous forme de bandes clairement définies. L’étalon ou l’échelle D’ADN doit être séparé de manière à permettre la détermination utile de la taille des bandes d’échantillons. Dans cet exemple, des fragments D’ADN de 765 paires de bases, 880 paires de bases et 1022 paires de bases sont séparés sur un 1.,Gel d’agarose à 5% avec une échelle D’ADN à 2 log.
en plus de confirmer la présence d’un fragment D’ADN d’intérêt, l’électrophorèse sur GEL D’ADN peut être associée à des procédures de purification sur gel. Typiquement, une lame de rasoir est utilisée pour découper le fragment d’ADN d’intérêt, de sorte qu’il puisse être collecté et l’échantillon D’ADN qu’il contient récupéré.,
L’électrophèse sur gel D’Agarose peut également être combinée avec le transfert de transfert, qui consiste à permettre à L’ADN, ou à L’ARN, de se transférer vers une membrane de cellulose où des sondes radioactives peuvent être utilisées pour identifier des séquences D’ADN ou D’ARN spécifiques dans votre échantillon séparé par électrophorèse.
l’électrophorèse sur GEL D’ADN Standard n’est pas idéale pour la séparation d’ADN de poids moléculaire élevé supérieur à 15-20 kb, comme L’ADN génomique. Pour séparer de grands échantillons D’ADN, on utilise l’électrophorèse sur gel à champ pulsé, qui consiste à soumettre le gel à un champ électrique changeant ou pulsant dans différentes directions., Cette technique implique un appareil de course de gel spécialisé, qui a des paires d’électrodes disposées dans différentes orientations autour du gel. Cela peut être utilisé pour détecter les différences de taille du génome entre les populations d’organismes, comme les échantillons d’ADN mis en commun de différentes communautés microbiennes, vous voyez ici qui sont prélevés dans différents environnements lacustres.
vous venez de voir une introduction à l’électrophorèse sur GEL D’ADN., Nous vous avons montré le concept derrière la méthode, comment préparer le gel d’agarose, comment charger vos échantillons, comment exécuter le gel, et l’analyser ainsi que certaines applications courantes de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec l’exécution de votre gel.