évaluation pulmonaire. Les tests de la fonction pulmonaire (PFT) ont été effectués avec un spiromètre Brentwood dans notre bureau. Certains patients avaient subi des tests ailleurs.
tests immunitaires. Les Tests ont été effectués dans les laboratoires D’Immunosciences sous la direction de A. Wojdani, Ph. D.. Compte tenu de l’importance de ces tests dans le cadre de cette évaluation, la méthodologie est décrite en détail.,
préparation de conjugués formaldéhyde-albumine sérique humaine (F-HSA) et formaldéhyde-albumine sérique bovine (F-BSA):
Une comparaison électrophorétique et immunoélectrophorétique de HSA, BSA avec F-HSA et F-BSA a été effectuée pour déterminer l’occurrence de la conjugaison. La conjugaison a été mise en évidence par une mobilité altérée de F-HSA, F-BSA lorsqu’elle a été comparée à HSA ou BSA respectivement. De plus, le nombre de groupes amino add libres présents dans le F-HSA ou le F-BSA a été déterminé par la méthode de Snyder et Sobocinski (1975) et a été utilisé pour évaluer la quantité de substitution., Le nombre de groupes amino liés au formaldéhyde était de 26 pour le HSA et de 31 pour le BSA. Dans ce calcul, La formation de réticulation intermoléculaire a été considérée.
préparation de conjugués diisocyanate de toluène-albumine sérique humaine (TDI-HSA) et albumine sérique Bovine (TDI-BSA):
cette préparation était similaire aux méthodes de Dewar et Baur (1982). Selon cette méthode, 1G HSA ou 1G BSA a été dissous dans 100 ml d’une solution tampon contenant du chlorure de potassium (0,05 mol/l), du borate de sodium (0,05 mol/l), PH 9,4 et refroidi à 4 C. Dioxane (10 ml) contenant 0.,15 ml de diisocyanate de toluène ont ensuite été ajoutés goutte à goutte en remuant sur une période de 3 heures, suivi de l’ajout de 2 ml d’éthanolamine, de la centrifugation, de la filtration par dialyse et de la lyophilisation. Semblable à F-HSA et F-BSA, la conjugaison a été confirmée par électrophorèse et détermination des groupes amino libres présents dans le conjugué. Le nombre de groupes amino liés à TDI était de 37 pour HSA et de 43 pour BSA. De plus, une analyse spectrographique du conjugué a été entreprise selon Zeiss et. Al. (1980)., Il y a eu une augmentation marquée de l’absorption de 230 à 260 nm, ce qui indique que la DJT est devenue liée de manière covalente au transporteur protéique. Cette augmentation de l’absorption ne correspondait à la détermination du groupe NH2 que de 76% pour HSA et de 81% pour BSA
préparation d’anhydride trimellitique-albumine sérique humaine (TMA-HSA) et d’anhydride trimellitique-albumine sérique bovine (TMA-BSA):
pour préparer ces conjugués 25 mg. de TMA a été dissous dans 0,5 ml de dioxane et ajouté goutte à goutte soit à 25 mg de HSA ou de BSA dissous dans 5 ml de NaHCO3 froid à 7% dans l’eau., Après agitation pendant 60 minutes à 4 C, les conjugués ont été dialysés contre quatre changements de 0,1 M NaHCO3 et un changement de tampon. Enfin, les conjugués ont été filtrés et maintenus à -20 C jusqu’à leur utilisation. Des analyses OD de TMA-HSA et de TMA-BSA ont été effectuées pour déterminer le nombre de résidus de TMA liés à la protéine porteuse correspondante. La concentration de la protéine porteuse a été convertie en concentration molaire avec le poids moléculaire de HSA et BSA. À partir du rapport de la concentration molaire du ligand TMA et du transporteur protéique, le rapport des résidus TMA par molécules de transporteur a été calculé., On a estimé que le TMA-HSA contenait 5 résidus de TMA par molécule de HSA et, pour le TMA-BSA, sept résidus par molécule d’albumine (Pien et al., 1988).
préparation de conjugués anhydride phtalique-albumine sérique humaine (PA-HSA) et anhydride phtalique-albumine sérique bovine (PA-BSA):
ces conjugués haptén ont été préparés en ajoutant 75 mg de PA à une solution refroidie de 300 mg de HSA ou de BSA dans 100 ml de H2O. le mélange réactionnel a été agité pendant une nuit, dialysé contre 8000 Dalton. En utilisant la méthode de Zeiss et. Al. (1977), les rapports molaires ont été calculés., Les rapports molaires sont de 22/28 pour PA/HSA et de 25/30 pour PA / BSA.
préparation des conjugués du cycle benzénique HSA (B-HSA) et du cycle benzénique BSA (B-BSA):
pour ces préparations, 40 mg. de l’acide P-aminobenzoïque a été dissous dans 2 ml de 1 N HCL et refroidi par immersion dans un bain de glace. Une solution froide de 14 mg/ml a été ajoutée goutte à goutte. Après chaque addition, le mélange a été agité pendant 30 secondes. En parallèle, un gramme de HSA ou de BSA a été dissous dans de l’acide borique 0,16 M de chlorure de sodium (0-15 M) tampon PH 9,0 (PH a été augmenté avec NaOH)., Les béchers contenant les solutions d’albumines étaient entourés d’un bain de glace sur agitateur magnétique. La solution de sel de diazonium a été ajoutée goutte à goutte, sous agitation rapide à la solution protéique froide. Après addition de chaque goutte, le PH est réajusté à 9,0 à 9,5 avec un NaOH normal. Lorsque toute la solution a été ajoutée, on laisse la réaction se poursuivre avec une agitation lente pendant au moins une heure avec d’autres ajouts de solution de NaOH et en maintenant le PH dans la plage de 9,0 à 9,5., Les petites molécules qui n’ont pas réagi ont été éliminées par dialyse intensive ou par passage à travers une colonne de sephadex G-25 dans la chambre froide, avec une solution de sel isotonique comme tampon d’élution. Des analyses OD du développement de la couleur orange de B-HSA et B-BSA ont été effectuées pour déterminer le nombre de résidus B liés à la protéine porteuse correspondante. La quantité de substitution de B pour HSA était d’environ 41 et pour BSA 53 (Migrdichian, 1957).
détermination des anticorps:
des anticorps spécifiques contre F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA et B-HSA ont été analysés par un test ELISA non compétitif., Des puits de plaques de microtitres (Dynatech, Alexandria, VA) ont été recouverts de 100 1 de solutions antigéniques (100 g/ml) dans 0,1 M PBS PH 7,2 pendant une nuit à 4 C. Les plaques ont été lavées 4 fois avec 0,1 M PBS contenant 0,05% entre chaque étape. Les sites d’absorption libres ont été bloqués avec 2% d’albumine sérique bovine sans protéase à température ambiante pendant 4 heures et conservés à -20 C jusqu’à utilisation.,
procédure analytique:
la procédure comprenait les éléments suivants: (1) lavage quatre fois, (2) addition de 100 1 de sérum dilué (1:2 pour Lesge et 1:100 pour les IgM et les IgG) dans PBS tween-20 avec 1% de BSA (3) incubation pendant 4 heures à 20 C, suivie d’un lavage 4 fois, (4) addition de 100 1 d’une dilution optimale d’alkaline 200), IgM (1:500) et anti IgG (1:1000), achetés auprès de KPI (Maryland) (5) incubation pendant 120 minutes à 20 C, (6) lavage 6 fois, (7) addition de 100 1 de phosphate de p-nitrophényle (Sigma chemical co.,) (8) incubation pendant 60 minutes à 20 C (9) addition de 50 1 de solution d’hydroxyde de sodium 3 N, et (10) lecture en double. Les résultats ont été calculés sur la base d’absorbances d’échantillons en double de 405 nm à l’aide d’un lecteur de microtitres. Tous les échantillons ont été lus par rapport à un antigène HSA comme témoin de liaison non spécifique à F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA et B-HSA. Les résultats ont été exprimés en titre. Le titre est la dernière dilution du sérum donnant une absorbance deux fois supérieure au contrôle HSA.,
études de spécificité et D’Inhibition croisée:
pour la détermination de la spécificité des anticorps, une étude d’inhibition croisée a été entreprise. Des sérums positifs pour chaque conjugué haptène-protéine ont été exécutés après une incubation et une précipitation appropriées avec des incréments décuplés de HSA ou de BSA liés à l’haptène en tant qu’inhibiteurs pour couvrir la gamme d’anticorps contre l’excès d’antigène. Cette fourchette était comprise entre 50 g et 1000 g pour hapten-BSA et 80 g à 1000 g pour hapten-RSA., Après incubation à 37 C et élimination du précipité par centrifugation, les échantillons de l’étude d’inhibition croisée avant et après ont ensuite été placés sur des plaques avec des puits recouverts du conjugué spécifique. Les étapes suivantes ont été suivies comme décrit ci-dessus pour L’étude ELISA.
la liaison des anticorps IgG et IgM à différents conjugués a été inhibée par hapten-HSA ou hapten-BSA de 36 à 85%. À une concentration donnée, hapten-HSA et hapten-BSA ont inhibé le niveau d’anticorps de manière similaire.,
une inhibition partielle de la liaison des anticorpsge à différents conjugués de l’haptène a été observée lorsque le sérum a été pré-incubé avec l’haptène-HSA ou l’haptène-BSA. Cette observation incomplète de l’inhibition de l’anticorpsge était principalement liée à la non-disponibilité du sérum avec des titres élevés D’ge contre différents produits chimiques dans notre laboratoire.,
détermination des niveaux normaux d’anticorps (témoins):
sur la base des procédures ci-dessus, 160 échantillons de donneurs de sang d’individus en bonne santé, des deux sexes, âgés de 22 à 55 ans, ont été examinés pour les niveaux d’anticorps contre F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA et B-HSA. Le titre moyen était de 1:800 400 pour les IgG, 1:3200 1600 pour les IgM et 1: 8 4 pour Lesge. Ainsi, dans notre laboratoire, les titres supérieurs à 1:1600 pour les IgG, 1:6400 pour les IgM et 1: 16 pour Lesge sont considérés comme positifs.,
chez un patient donné, les augmentations ou les baisses des titres d’anticorps par Plus d’une dilution ont été considérées comme significatives (Voir tableaux).
énumération des sous-ensembles lymphocytaires:
un cytomètre de flux laser unique (profil Epics: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL) qui discrimine la diffusion de la lumière en avant et à angle droit, ainsi que deux couleurs, a été utilisé avec un progiciel (Quad Stat: Coulter). Les populations de cellules mononucléées ont été déterminées par immunofluorescence directe bicolore à l’aide d’une technique de coloration du sang total avec l’anticorps monoclonal approprié et la cytométrie en flux (Fletcher et al.,, 1989) les paires suivantes d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou d’anticorps monoclonaux conjugués à la phycoérythrine (PE) (Immunologie de Coulter) ont été sélectionnées: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI et T11-FITC/tal-PE pour la détermination des cellules T/B, T-helper/T-suppresseur, NKHT3+ /nkhy3 et pour la voie alternative de l’activation lymphocytaire respectivement.
pour surveiller les marqueurs lymphocytaires, on a établi des cartes bat sur la population lymphocytaire de la diffusion de la lumière à angle avant par rapport à un histogramme de diffusion de la lumière à 90., Le pourcentage de cellules colorées positivement pour chaque paire de marqueurs, ainsi que le pourcentage de cellules doublement colorées ont été déterminés. Les estimations du nombre absolu de lymphocytes positifs pour les marqueurs de surface respectifs ont été déterminées en multipliant le nombre de cellules lymphocytaires périphériques par le pourcentage de cellules colorées positivement pour chaque paire de marqueurs. En outre, le pourcentage de cellules doublement colorées a été déterminé., Les estimations du nombre absolu de lymphocytes positifs pour les marqueurs de surface respectifs ont été déterminées en multipliant le nombre de cellules lymphocytaires périphériques par le pourcentage de cellules positives pour chaque marqueur de surface.
mesure des anticorps anti-protéine de base de la myéline:
La protéine de base de la myéline humaine (HMBP) a été préparée par la méthode de Diebler et al. (1972) et vérifié la pureté par électrophorèse sur gel de polyacrylamine. L’antisérum à HMBP a été induit chez le lapin par injection répétée de hmbp dans l’adjuvant complet de Freund., L’activité des anticorps dans les sérums de lapin et les échantillons du patient a été détectée en ajoutant différentes dilutions (1:100 à 1:10 000) de sérums aux puits d’une plaque de microtitre préalablement revêtue de HMBP comme suit: HMBP 250 g/ml a été dissous dans un tampon de carbonate, PH 9,6 et 200 l de cette solution ont Après incubation, lavage et blocage comme ci-dessus, 200 1 de sérum de lapin ou humain dilué ont été ajoutés aux puits. Après incubation pendant une heure à 37 C, les sérums ont été secoués hors des puits, puis lavés 5 fois avec une solution de lavage., 200 1 d’IgG, D’IgM ou D’IgA (dilution optimale) de chèvre anti-lapin ou de chèvre anti-humain conjugués à la peroxydase ont été ajoutés au puits approprié. Après incubation et lavage répété 200 1 de substrat ABTS ont été ajoutés à chaque puits. Les plaques ont été incubées pendant une heure à température ambiante et lues dans un lecteur de microtitres à une longueur d’onde de 405 tun. En utilisant des antisérums de lapin; une courbe de titrage a été tracée et les sérums du patient ont été comparés à cette courbe standard., Sur la base de plus de 200 contrôles et des déterminations d’échantillons de patients, des litres supérieurs à 1:2000 pour les IgA, 1:5000 pour les IgM et 1:8000 pour les IgG ont été considérés positifs.