SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel d’électrophorèse) est couramment utilisé en laboratoire pour la séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire. C’est l’une de ces techniques qui est couramment utilisée mais pas souvent entièrement comprise. Donc, nous allons essayer de résoudre cela.
SDS-PAGE sépare les protéines en fonction de leur poids moléculaire, en fonction de leurs taux différentiels de migration à travers une matrice de tamisage (un gel) sous l’influence d’un champ électrique appliqué.,
rendre le taux de Migration des protéines proportionnel au poids moléculaire
le mouvement de toute espèce chargée à travers un champ électrique est déterminé par sa charge nette, son rayon moléculaire et l’amplitude du champ appliqué. Mais le problème avec les protéines repliées nativement est que ni leur charge nette ni leur rayon moléculaire ne dépendent du poids moléculaire. Au lieu de cela, leur charge nette est déterminée par la composition en acides aminés, c’est-à-dire la somme des acides aminés positifs et négatifs dans la protéine et le rayon moléculaire par la structure tertiaire de la protéine.,
ainsi, dans leur état natif, différentes protéines de même poids moléculaire migrent à différentes vitesses dans un champ électrique en fonction de leur charge et de leur forme 3D.
pour séparer les protéines dans un champ électrique en fonction de leur poids moléculaire uniquement, nous devons détruire la structure tertiaire en réduisant la protéine en une molécule linéaire, et masquer en quelque sorte la charge nette intrinsèque de la protéine. C’est là que le SDS entre en jeu.,
le rôle de SDS (et al.)
SDS est un détergent présent dans le tampon d’échantillon SDS-PAGE où, avec un peu d’ébullition, et un agent réducteur (normalement DTT ou B-ME pour décomposer les liaisons disulfure protéine-protéine), il perturbe la structure tertiaire des protéines. Cela ramène les protéines repliées à des molécules linéaires.
le SDS recouvre également la protéine d’une charge négative uniforme, ce qui masque les charges intrinsèques sur les groupes R. SDS se lie assez uniformément aux protéines linéaires (autour de 1.,4G SDS / protéine 1G), ce qui signifie que la charge de la protéine est maintenant approximativement proportionnelle à son poids moléculaire.
le SDS est également présent dans le gel pour s’assurer qu’une fois les protéines linéarisées et leurs charges masquées, elles le restent tout au long de la course.
le facteur dominant dans la détermination d’une protéine revêtue de SDS est son rayon moléculaire., Il a été démontré que les protéines revêtues de SDS sont des molécules linéaires, 18 Angstroms de large et avec une longueur proportionnelle à leur poids moléculaire, de sorte que le rayon moléculaire (et donc leur mobilité dans le gel) est déterminé par le poids moléculaire de la protéine. Étant donné que les protéines revêtues de SDS ont le même rapport charge / masse, il n’y aura pas de migration différentielle basée sur la charge.
la matrice de Gel
Dans un champ électrique appliqué, les protéines traitées par SDS vont maintenant se déplacer vers l’anode positive à des vitesses différentes en fonction de leur poids moléculaire., Ces différentes mobilités seront exagérées en raison de l’environnement à haute friction d’une matrice de gel.
comme son nom l’indique, la matrice de gel utilisée pour SDS-PAGE est le polyacrylamide, ce qui est un bon choix car il est chimiquement inerte et, surtout, peut facilement être composé à une variété de concentrations pour produire différentes tailles de pores donnant une variété de conditions de séparation qui peuvent être modifiées en fonction de vos besoins. Vous vous souvenez peut-être que j’ai déjà écrit un article sur le mécanisme de polymérisation de l’acrylamide.,
le système tampon discontinu et le Gel D’empilement – les alignant à la ligne de départ
pour conduire le courant de la cathode (négative) à l’anode (positive) à travers le gel, un tampon est évidemment nécessaire. La plupart du temps, nous utilisons le système tampon discontinu Laemmli. « Discontinu » signifie simplement que le tampon dans le gel et le réservoir sont différents.
typiquement, le système est mis en place avec un gel empilable à pH 6,8, tamponné par Tris-HCl, un gel courant tamponné à pH 8,8 par Tris-HCl et un tampon d’électrode à pH 8,3., Le gel d’empilement a une faible concentration d’acrylamide et le gel de course une concentration plus élevée capable de retarder le mouvement des protéines.
Donc ce qui est avec tous ces différents pH?
Eh bien, la glycine peut exister dans trois états de charge différents, positifs, neutres ou négatifs, en fonction du pH. Ceci est illustré dans le schéma ci-dessous. Le contrôle de l’état de charge de la glycine par les différents tampons est la clé de l’ensemble du gel d’empilage.,
voici Donc comment l’empilement de gel de travaux. Lorsque l’alimentation est mise sous tension, les ions glycine chargés négativement dans le tampon d’électrode à pH 8,3 sont forcés d’entrer dans le gel d’empilage, où le pH est de 6,8. Dans cet environnement, la glycine passe principalement à l’état zwitterionique (chargé neutre). Cette perte de charge les fait se déplacer très lentement dans le champ électrique.
Les ions Cl (issus de Tris – HCl), quant à eux, se déplacent beaucoup plus rapidement dans le champ électrique et forment un front ionique qui migre en avant de la glycine., La séparation de Cl-du contre-ion Tris (qui se déplace maintenant vers l’anode) crée une zone étroite avec un gradient de tension raide qui tire la glycine derrière elle, ce qui entraîne deux fronts étroitement séparés d’ions migrateurs; le front Cl – très mobile, suivi du front glycine plus lent, principalement neutre.,
Toutes les protéines de l’échantillon de gel ont une mobilité électrophorétique intermédiaire entre l’extrême de la mobilité de la glycine et de la Cl-, de sorte que lorsque les deux fronts traversent bien l’échantillon, les protéines sont concentrées dans la zone étroite entre les fronts Cl – et glycine.
Et c’est parti!
cette procession se poursuit jusqu’à ce qu’elle touche le gel en cours d’exécution, où le pH passe à 8,8. À ce pH, les molécules de glycine sont principalement chargées négativement et peuvent migrer beaucoup plus rapidement que les protéines., Ainsi, le front de glycine accélère au-delà des protéines, les laissant dans la poussière.
le résultat est que les protéines sont déversées dans une bande très étroite à l’interface des gels d’empilage et de course et comme le gel de course a une concentration accrue d’acrylamide, ce qui ralentit le mouvement des protéines en fonction de leur taille, la séparation commence.
Ce qui Était Tout le ce Sujet?
Si vous vous demandez toujours pourquoi le gel d’empilage est nécessaire, pensez à ce qui se passerait si vous n’en utilisiez pas.,
Les puits de Gel sont d’environ 1 cm de profondeur et vous devez généralement les remplir substantiellement pour obtenir suffisamment de protéines sur le gel. Donc, en l’absence d’un gel empilable, votre échantillon reposerait sur le gel en cours d’exécution, sous la forme d’une bande allant jusqu’à 1 cm de profondeur.
plutôt que d’être alignés ensemble et de frapper le gel de course ensemble, cela signifierait que les protéines de votre échantillon entreraient toutes dans le gel de course à différents moments, ce qui entraînerait des bandes très tachées.,
ainsi, le gel d’empilement garantit que toutes les protéines arrivent au gel en cours d’exécution en même temps, de sorte que les protéines de même poids moléculaire migrent sous forme de bandes serrées.
séparation
Une fois que les protéines sont dans le gel en cours d’exécution, elles sont séparées parce que les protéines de poids moléculaire plus élevé se déplacent plus lentement à travers le gel d’acrylamide poreux que les protéines de poids moléculaire inférieur. La taille des pores dans le gel peut être modifiée en fonction de la taille des protéines que vous souhaitez séparer en modifiant la concentration d’acrylamide. Les valeurs typiques sont indiquées ci-dessous.,
pour une plage de séparation plus large, ou pour les protéines difficiles à séparer, un gel dégradé, qui a des couches de concentration croissante d’acrylamide, peut être utilisé.