Qu’est-ce que la cytométrie en flux (analyse FACS)?

développée à l’origine à la fin des années 1960, la cytométrie en flux est une technique de biologie cellulaire analytique populaire qui utilise la lumière pour compter et profiler les cellules dans un mélange de fluides hétérogènes. La cytométrie en flux est une méthode particulièrement puissante car elle permet à un chercheur de collecter rapidement, avec précision et simplement des données relatives à de nombreux paramètres à partir d’un mélange fluide hétérogène contenant des cellules vivantes.,

la cytométrie en flux est largement utilisée tout au long de la vie et des sciences biomédicales, et peut être appliquée dans n’importe quel scénario où un chercheur a besoin de profiler rapidement une grande population de cellules lâches dans un milieu liquide. Par exemple, en immunologie, la cytométrie en flux est utilisée pour identifier, séparer et caractériser divers sous-types de cellules immunitaires en raison de leur taille et de leur morphologie.

lorsque des informations supplémentaires sont nécessaires, des anticorps marqués avec des colorants fluorescents et élevés contre des antigènes de surface cellulaire hautement spécifiques (par exemple, on peut utiliser des clusters de différenciation ou des marqueurs CD) pour mieux identifier et séparer des sous-populations spécifiques au sein d’un groupe plus large.

dans un cytomètre de flux

• Les cellules D’échantillon sont passées par un canal étroit une à la fois.
• La Lumière est utilisée pour éclairer les cellules du canal.
• Une série de capteurs détectent les types de lumière réfractée ou émise par les cellules.
• Les données acquises par les capteurs sont compilées et intégrées pour construire une image complète de l’échantillon.,

FACS Anticorps actuellement utilisés pour la Recherche des

les Différents Types de Lumière utilisée dans une Cytométrie de Flux Expérience

Un cytomètre de flux utilise de réfraction ou de la lumière émise à compter et identifier les cellules. Découvrez les différents types de lumière utilisés dans une expérience de cytométrie en flux dans les figures suivantes.,

diffusion vers l’avant

La lumière diffusée vers l’avant est réfractée par une cellule dans le canal d’écoulement et continue le long du trajet de la lumière (c’est-à-dire La lumière diffusée vers l’avant est détectée par un capteur dans le trajet de la lumière et est généralement utilisée pour identifier la taille des particules.

la lumière diffusée vers l’avant est le plus souvent utilisée pour détecter la taille de l’objet dans le trajet lumineux., Les objets plus grands produiront plus de lumière diffusée vers l’avant que les objets plus petits, et les cellules plus grandes auront un signal de diffusion vers l’avant plus fort

diffusion latérale

lumière diffusée latérale la lumière passe de réfracté par des cellules dans une direction qui est en dehors du chemin lumineux original. La lumière diffusée latéralement est détectée par un capteur orthogonal au trajet lumineux d’origine.,

la lumière diffusée de côté est généralement utilisée pour déterminer la granularité et la complexité de la cellule dans le trajet lumineux. Les cellules hautement granulaires avec une grande quantité de complexité interne, comme les neutrophiles, produiront plus de lumière diffusée latéralement et un signal de diffusion latérale plus élevé que les cellules à faible granularité et complexité.

Émission de Fluorescence

la lumière Fluorescente émise par les molécules fluorescentes après excitation par un compatible longueur d’onde laser., La lumière fluorescente peut provenir de matériaux naturellement fluorescents dans la cellule, ou peut provenir de colorants fluorescents ou d’anticorps marqués par fluorescence qui ont été utilisés pour marquer une structure spécifique sur la cellule.

analyse multiparamétrique

Une simulation de cytométrie en flux dot-plot, traçant vers l’avant vs côté-dispersés à partir d’une population de leucocytes., Les populations cellulaires sont marquées par leur identité probable:

d débris présumés, très petits objets avec une faible dispersion vers l’avant et vers le côté.

L/M leucocytes/monocytes probables, petites à moyennes cellules avec une faible complexité / granularité interne. Ces cellules génèrent une diffusion moyenne vers l’avant et une faible intensité du signal de diffusion latérale

G granulocytes probables, de grandes cellules présentant une complexité/granularité interne élevée. Ces cellules génèrent des signaux de dispersion vers l’avant et vers l’arrière élevés.,

alors que certaines identités peuvent être confirmées par des profils de dispersion directe et latérale, le marquage avec un marqueur spécifique de type de cellule fournit toujours une plus grande résolution et une plus grande certitude lors du profilage de populations hétérogènes complexes de cellules.

par exemple, dans le graphique ci-dessus, un chercheur peut être en mesure de faire la distinction entre les granulocytes et les lymphocytes en utilisant la lumière diffusée vers l’avant et sur le côté. Cependant, trois classes de granulocytes (neutrophiles, basophiles et éosinophiles) sont très similaires en taille et en structure, ce qui leur confère des propriétés de diffusion de la lumière similaires., Dans ce cas, les neutrophiles pourraient être marqués sélectivement en raison de leur expression d’un marqueur spécifique aux neutrophiles comme L’ELANE.

FACS: tri des cellules basé sur des données de cytométrie en flux

les Termes cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) sont souvent utilisés de manière interchangeable. En pratique, il existe des différences entre les deux méthodes.

FACS est un dérivé de la cytométrie en flux qui ajoute un degré exceptionnel de fonctionnalité. En utilisant FACS, un chercheur peut trier physiquement un mélange hétérogène de cellules en différentes populations.,

en utilisant des anticorps hautement spécifiques marqués avec des colorants fluorescents, un chercheur peut effectuer une analyse FACS et simultanément recueillir des données sur un échantillon et le Trier par un nombre presque illimité de paramètres différents.

dans une expérience FACS:

• des données de diffusion avant, de diffusion latérale et de fluorescence sont collectées, comme dans la cytométrie en flux conventionnelle.
• Les paramètres définis par l’utilisateur fournissent des informations sur la façon dont les cellules doivent être triées.
• sur la base de ces paramètres, la machine FACS utilise une électrode pour imposer une charge électrique sur chaque cellule.,
• à la sortie de la chambre d’écoulement, les électroaimants trieront les cellules par charge dans des récipients séparés.

à quoi ressemblent les données de cytométrie en flux?

dans une expérience de cytométrie en flux, chaque cellule qui traverse le cytomètre en flux et est détectée sera classée comme un événement distinct.

de plus, chaque type de lumière détectée par le cytomètre en flux (diffusion vers l’avant, diffusion latérale et chaque longueur d’onde d’émission de fluorescence) se verra attribuer son propre canal unique., Les données de cytométrie en flux traceront chaque événement indépendamment et représenteront l’intensité du signal de lumière détectée dans chaque canal pour chaque événement.

Les données de cytométrie en flux sont généralement représentées de deux manières: les histogrammes, qui mesurent ou comparent un seul paramètre, et les diagrammes à points qui comparent 2 ou 3 paramètres simultanément sur un nuage de points bidimensionnel ou tridimensionnel.

Un histogramme généralement des parcelles de l’intensité détectée dans un seul canal le long d’un axe et le nombre d’événements détectés à cette intensité est dans un axe distinct., Un grand nombre d’événements détectés à une intensité particulière sera affiché en tant que pic sur l’histogramme.

en revanche, dans un diagramme à points, chaque événement est représenté comme un seul point sur un nuage de points. L’intensité de 2 canaux différents (ou 3 canaux différents dans un tracé tridimensionnel) est représentée le long des différents axes. Les événements avec des intensités similaires se regrouperont dans la même région sur le nuage de points.

les histogrammes et les diagrammes à Points offrent tous deux différents avantages pour l’analyse des données de cytométrie en flux. Choisir la meilleure façon de représenter vos données peut vous aider à vous assurer qu’elles racontent une histoire complète dans un format simple et compréhensible.

Les tracés par points et les histogrammes ne s’excluent pas mutuellement, et la plupart des expériences complexes de cytométrie en flux utilisent plusieurs tracés pour afficher des données riches et multi-paramétriques sur un échantillon.

Dans de nombreux cas, plus de trois paramètres doivent être représentées simultanément., Dans ce cas, une technique d’analyse de données connue sous le nom de gating peut aider à donner une résolution et une flexibilité supplémentaires, permettant l’analyse d’une quantité presque illimitée de paramètres simultanément sur plusieurs diagrammes de dispersion et histogrammes différents.

Gating ajoute de la résolution aux données de cytométrie en flux

en bref, gating est une méthode pour sélectionner des cellules à partir d’une expérience de cytométrie en flux que vous souhaitez analyser plus en détail., Le Gating permet à un chercheur de recueillir et d’Afficher plus d’informations sur une sous – population de cellules que ce qui pourrait normalement être affiché sur un diagramme à points en 2 ou 3 dimensions.

Gating ajoute une résolution à une expérience de cytométrie en flux, et permet l’analyse simultanée d’un nombre presque illimité de paramètres différents (canaux).

dans une expérience de cytométrie en flux fermée:

• Un utilisateur collecte des données de cytométrie en flux à partir d’un ou plusieurs canaux sur un diagramme à points.
• sur la base des données acquises, l’utilisateur dessine une boîte de porte sélectionnant une sous-population de cellules pour une analyse plus approfondie.,
• la sous-population de cellules à l’intérieur de la porte sera spécifiquement mise en évidence sur d’autres tracés affichant des informations provenant d’autres canaux.

Gates ajoute une incroyable flexibilité à la cytométrie en flux, accordant jusqu’à une résolution unicellulaire pour chaque canal disponible pour le chercheur. Plusieurs portes peuvent être établies pour un seul nuage de points, et les portes peuvent être « empilées » et combinées (c’est-à-dire qu’une sous-population de cellules fermées pour les canaux 1 et 2 peut être fermée pour les canaux 3 et 4 pour permettre une plus grande spécificité et une analyse plus approfondie).,

Un exemple de déclenchement

Une remarque sur la Rémunération

le Débordement d’un canal dans un autre, peut causer faussement positifs identifié des signaux. Le débordement est le signal artefactuel qu’un colorant fluorescent peut provoquer dans le canal d’un autre fluorophore en fonction de sa luminosité relative et de son spectre d’émission. C’est là que la compensation entre en jeu. La Compensation est une procédure qui isole le signal d’un canal particulier des autres canaux utilisés dans la même expérience. FITC par exemple, a son pic d’émission dans la gamme verte du spectre électromagnétique. Il fait cependant également fluorescence dans le canal jaune où PE émet de la lumière. En termes simples, la compensation soustrait le signal FITC du canal PE.

Ce signal dans le « mauvais” de canal est soustrait du signal causé par le fluorophore d’intérêt. Dans l’échantillon ci-dessus, le rapport entre la composante verte et la composante jaune à une longueur d’onde d’excitation donnée est constant pour FITC., Il est ainsi possible de déduire la quantité de signal FITC jaune non spécifique dans le canal PE à partir de la mesure dans le canal vert en utilisant les coefficients de compensation constants. La même chose est vraie pour le débordement du PE dans le canal FITC.