Specificity and Efficiency of the Uracil DNA Glycosylase-Mediated Strand Cleavage Surveyed on Large Sequence Libraries

UDG-mediated uracil excision and chemical AP site cleavage on microarrays

le clivage des brins d’ADN médié par UDG se compose de deux étapes distinctes: le site Abasique résultant. Les deux étapes peuvent être surveillées séparément sur des puces à ADN., Tout d’abord, des sites abasiques sont générés en traitant le réseau avec UDG et dans un deuxième temps, le clivage des brins est induit en exposant les oligonucléotides D’ADN attachés à la surface contenant des sites abasiques à des conditions acides ou basiques, ou en évaporant la surface à sec. De telles stratégies chimiques pour cliver les sites abasiques sur les brins D’ADN éliminent le besoin de clivage enzymatique supplémentaire et permettent d’étudier indépendamment la cinétique de L’UDG., À cette fin, des réseaux de séquences D’ADN 30mer avec un nombre croissant d’incorporations non consécutives de dU (dU1-dU9) ont été conçus et synthétisés par photolithographie d’acide nucléique sans masque, en utilisant la phosphoramidite du photosensible correspondante (Fig. 2). Chaque brin D’ADN a été synthétisé avec un lieur dT15 à la surface du verre et terminé à l’extrémité 5’avec une séquence cible 25MER pour l’hybridation (QC25), comme indiqué sur la Fig. 3.,

l’emplacement de toutes les séquences de sonde ainsi que les répliques correspondantes et les brins de contrôle portant des nucléotides DT au lieu de nucléotides dU a été randomisé à travers la surface de la puce., Avant le traitement enzymatique, les séquences de la sonde D’ADN ont été hybridées à L’oligonucléotide complémentaire 25mer marqué en Cy3 (QC25c) afin de déterminer les valeurs initiales d’intensité de fluorescence. Le marquage 3 ‘ – Cy3 a été utilisé pour prévenir d’éventuels artefacts de fluorescence dus aux interactions du colorant avec le nombre variable de dUs46. Les puces ont ensuite été exposées à de L’UDG d’origine commerciale provenant d’E. coli et le clivage du site abasique a ensuite été effectué dans diverses conditions. Le temps d’exposition optimal de l’enzyme a été déterminé dans les premières expériences. Nos résultats (fig., S1) montrent qu’après addition de l’enzyme, l’efficacité du clivage augmente significativement avec le temps, jusqu’à une heure, atteignant une efficacité d’environ 50-60%, avec seulement de légers changements lors d’une exposition ultérieure à UDG. Nous réglons ainsi le temps d’exposition optimal à une heure. De plus, nos données montrent clairement une efficacité accrue du clivage avec un nombre croissant d’UA, de 40 à 60% (fig. 3C et S1).

Nous avons ensuite étudié l’étape de clivage proprement dite, l’élimination du site abasique après excision de la base uracile., Suivant des stratégies connues de clivage de sites abasiques induits chimiquement dans la solution20, 30, les sites AP résultants ont ensuite été clivés soit dans des conditions alcalines en immergeant les réseaux dans une solution 1:1 (V/V) d’éthylènediamine(EDA)/éthanol, soit dans des conditions acides en immergeant dans une solution à 30% (v/v) d’acide trichloroacétique dans le dichlorométhane, soit en évaporant la surface du réseau à sec. Dans toutes les méthodes, les traitements ont été effectués pendant différentes périodes, allant de 1 à 24 heures., Par la suite, les réseaux ont été réhybridisés en oligonucléotide 25mer complémentaire marqué en Cy3 (QC25c) et les intensités de fluorescence résultantes ont été comparées à celles obtenues avant le traitement UDG afin de déterminer l’efficacité du clivage. Les taux de clivage résultants sont indiqués sur la Fig. 4.

Sous conditions de base (Fig. 4B), le clivage des sites AP nécessite une période d’incubation minimale de 2 heures afin d’observer un clivage significatif (40 à 60%) des substrats. Cependant, traiter le réseau avec un acide ou sécher sa surface (Fig., 4A, C, respectivement) entraîne un clivage clair et étendu après seulement une heure (30 à près de 80% avec un traitement acide), lorsque le clivage du site abasique médié par L’EDA est minime après une heure. Il est probable que la réaction de clivage elle-même dans les méthodes A et C soit favorisée au stade final d’hybridation, soit en raison de la température ou de la présence d’une amine dans le tampon., Néanmoins, étant donné que l’hybridation est commune aux trois méthodes, les grandes différences de cinétique de clivage entre les traitements basiques et non basiques suggèrent la possibilité que des sites AP supplémentaires puissent être produits en présence d’un acide, ou sous pression réduite, donnant des positions supplémentaires sur les brins D’ADN à laquelle une réaction de clivage suivante peut se produire. Les traitements plus longs, quelle que soit la méthode, ne modifient pas de manière significative l’étendue du clivage, approchant généralement 40% à 80% selon le nombre d’incorporation de dU., En effet, nous constatons une nette augmentation globale de l’efficacité du clivage avec un nombre croissant de dU-incorporations, dans toutes les conditions testées.

en plus d’effectuer un clivage de brin d’ADN induit chimiquement sur des sites abasiques, la qualité de la surface des microréseaux a été examinée. À cette fin, l’uniformité des caractéristiques sur les surfaces du réseau a été inspectée visuellement en fonction des intensités de fluorescence et la perte de fluorescence pour les brins de contrôle non clivables a été surveillée., Nous avons constaté que le clivage du site abasique dans des conditions alcalines permettait un clivage spécifique à médiation enzymatique des séquences contenant dU, mais laissait les séquences témoins pratiquement intactes, tandis que dans des conditions acides, le clivage des brins D’ADN était également observé pour les brins témoins dépourvus de nucléotides d’uracile (Fig. S2). Le séchage de la surface a également conduit à la dégradation des brins de contrôle dT uniquement. Étant donné que seul le clivage abasique du site dans des conditions alcalines évite la dégradation de surface et la perte non spécifique d’ADN, nous avons effectué toutes les expériences ultérieures dans ces conditions., Cela garantit que les séquences de contrôle non clivables restent disponibles pour la comparaison même après un long traitement chimique.

dépendance de la séquence UDG simple et double brin

étant donné que nos résultats sur le clivage de dU médié par E. coli n’ont fourni que des rendements de clivage modérés pour les brins d’ADN contenant des incorporations de du simples (≈40%), nous avons interrogé la spécificité de la séquence de L’UDG afin À cette fin, nous avons conçu une bibliothèque d’acides nucléiques contenant dU à partir de séquences D’ADN double et simple brin., La bibliothèque se compose d’une séquence permutable 7mer avec un seul dU au milieu (Fig. 5). La Permutation des régions flanquantes 3-nt, 5′ – ainsi que 3 ‘ de l’ua donne 4096 séquences uniques. Dans le format double brin, une boucle et la séquence complémentaire au 7mer ont été ajoutées, conduisant à la formation d’une structure en épingle à cheveux. Des paires de bases dG·dC supplémentaires dans la tige de l’épingle à cheveux ont contribué à augmenter la température de fusion de la structure de l’ADN de l’épingle à cheveux. Ces paires de bases ont été ajoutées aux substrats monocaténaires afin de garder les conceptions ssDNA et dsDNA aussi similaires que possible., Enfin, un oligonucléotide 25mer a été ajouté à l’extrémité 5’de chaque plan afin de servir de cible d’hybridation. Une figure représentative des plans de séquence est représentée à la Fig. 5.

bien que le marquage terminal de L’ADN avec un colorant fluorescent soit une méthode pratique pour mesurer directement l’intensité de fluorescence, il présente l’inconvénient d’un bruit de fluorescence élevé qui, en particulier sur les puces à haute densité, rend l’extraction et l’interprétation Par conséquent, nous avons décidé de surveiller la réaction de clivage par hybridation aux séquences immobilisées., Avant le traitement par UDG, les substrats D’ADN simple et double brin ont été hybridés à l’oligonucléotide 25mer complémentaire marqué et scannés pour obtenir des valeurs initiales de fluorescence. Ensuite, les microréseaux ont été exposés à L’UDG pendant différentes périodes. Après le clivage suivant du site AP dans des conditions alcalines, les réseaux ont de nouveau été hybridés à leurs compléments marqués Cy3. La diminution du signal de fluorescence des brins D’ADN par rapport aux valeurs de fluorescence de prétraitement correspond directement à l’efficacité du clivage., Des efficacités de clivage maximales d’environ 40% ont été obtenues pour les substrats à double brin après incubation UDG pendant 2 minutes, et des taux de clivage légèrement inférieurs pour les substrats à simple brin (tableau S1). Ce taux plus faible pour les monocaténaires contredit des études antérieures indiquant qu’ils sont clivés plus rapidement que leurs équivalents bicaténaires13,47,48. Fait intéressant, des incubations enzymatiques très courtes (<1 min) conduisent toujours à des efficacités de clivage significatives (30-35%)., Ces points de temps courts sont particulièrement intéressants car ils donnent des indications claires sur les préférences de séquence potentielles. Afin d’identifier la dépendance de séquence dans la dégradation de L’ADN médiée par UDG de notre ensemble de 4096 brins individuels, nous nous sommes concentrés sur le 1% (Fig. 6) ainsi que 5% (fig. S3) du sous-ensemble de séquences le plus et le moins clivé. Les motifs de séquence représentatifs générés à partir de ces sous-ensembles de séquence sont illustrés à la Fig. 6 et dans les informations complémentaires.,

Pour le double-brin de l’ADN (Fig. 6A, B), les résultats montrent une nette préférence de séquence UDG pour les régions riches en G/C flanquant l’uracile. Inversement, UDG semble traiter mal les substrats double brin contenant des paires de bases T·A. Les motifs extraits de substrats UDG meilleurs et plus pauvres sont en accord partiel avec les données de la littérature existante très limitée48,49,50. Seibert et coll., on a émis l’hypothèse que L’efficacité D’E. coli UDG est liée au coût énergétique de la flexion et de la distorsion de l’ADN survenant dans le processus de reconnaissance des dommages spécifiques. Dans des simulations de dynamique moléculaire et des expériences de fluorescence résolues dans le temps avec deux séquences D’ADN double brin contenant de l’uracile, ils ont identifié que les constantes de force de flexion efficaces sont plus faibles si dAs ou dTs sont situés à proximité du nucléotide de l’uracile, au lieu de dGs et dCs; suggérant que les séquences riches en dA/DT pourraient être plus facilement, Puisque L’ADN monocaténaire est une forme beaucoup plus flexible d’ADN, son traitement plus rapide rapporté dans la littérature pourrait être dû au coût énergétique inférieur des substrats de clivage qui sont intrinsèquement plus flexibles que dsDNA7,47,49,51. Cependant, la flexion peut ne pas être un facteur déterminant dans la spécificité du clivage UDG de l’adnss, l’enzyme reconnaissant et clivant également tous les substrats, ce qui explique peut-être l’absence de consensus de séquence dans l’adnss contenant de l’ua., On a néanmoins émis l’hypothèse que les effets du contexte de séquence s’étendent encore à L’ADN simple brin, et ont effectivement été observés pour L’UDG du virus de l’herpès simplex de type 152, mais restent encore incertains pour L’UDG humain ou E. coli. Slupphaug et coll. on a mesuré la spécificité de séquence de L’UDG humain dans 34 contextes de séquence d’adnds et on a supposé que la dT 3′ à dU entraîne toujours une élimination lente, tout comme, de manière quelque peu discordante, un contenu élevé en GC50. Eftedal et coll. a évalué l’efficacité du clivage du thymus du veau et de L’UDG D’E. coli à partir de 41 séquences d’adnds et a trouvé un schéma similaire., Avec notre ensemble de séquences beaucoup plus grand, nous pouvons convenir que dT 3′ à dU entraîne toujours une suppression lente, mais nos données montrent clairement que dC, et dG dans une moindre mesure, 3′ à dU entraîne une suppression rapide. Nous n’avons pas été en mesure d’identifier une dépendance significative de la séquence pour l’excision de dU sur l’adnss (Fig. 6C, D). Il convient de noter que la dépendance de séquence dans les substrats dsDNA est claire pour les traitements enzymatiques courts (5s, 30s, 60s et 120s), mais s’estompe lentement pour une exposition plus longue à L’UDG (30min), indiquant que tous les substrats sont finalement clivés lorsqu’ils sont exposés à l’enzyme.,

optimisation des sites de clivage

comme aucune dépendance significative de séquence pour l’excision d’uracile médiée par L’UDG sur L’ADN simple brin n’a émergé de nos études et que des rendements de clivage plutôt modérés pour les incorporations simples de dU ont été obtenus, nous avons choisi d’étudier L’excision de du médiée par L’UDG sur des substrats simples plus longs contenant diverses formes d’incorporations multiples de dU, dans le but d’identifier des sites de clivage spécifiques qui sont facilement accessibles enzymatiquement et permettent un clivage rapide et efficace des brins., Notre raisonnement est que l’augmentation de la distance de la sonde de la surface devrait fournir une plus grande accessibilité pour le clivage, mais cet effet peut ne pas se répercuter sur les longues entretoises (>20-nt)53. Sur la base des résultats de la Fig. 3, nous nous attendons également à ce qu’un nombre plus élevé d’incorporations dU conduise à un clivage global plus important, mais nous nous demandons s’il existe une densité optimale de nucléotides dU dans la section clivable du brin D’ADN. Par conséquent, nous avons étudié le clivage de l’uracile sur des homopolymères dU plus longs (10, 15 et 20mers) ainsi que sur des oligomères dont la composition en dU varie en%., Le pourcentage de dU dans l’oligomère a été calculé par rapport aux quatre autres nucléotides (dA, dC, dG et dT) et obtenu expérimentalement en effectuant des réactions de couplage avec des solutions pré-mélangées de phosphoramidites dU/dA/dC/dG/dT dans divers rapports (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 ou 100: 0, (v/v) dU: dA / dC / dG / dT). Les séquences, construites sur des lieurs poly-dT de longueurs variables (dT1, dT5, dT10 et dT15), et la région contenant dU ont ensuite été terminées par une séquence cible 25mer à des fins d’hybridation, comme indiqué sur la Fig. 7.,

Après la synthèse, le 25mer a été hybridé à son oligonucléotide complémentaire marqué en 5′-Cy3 et le microréseau a été exposé à L’UDG pendant 1 heure., Ensuite, le clivage du site abasique a été réalisé dans des conditions alcalines, suivi d’une réhybridation finale. En parallèle, nous avons également effectué le test de clivage avec l’enzyme utilisateur, ce qui élimine dans ce cas le besoin d’une procédure de clivage abasique supplémentaire.

pour l’analyse enzymatique avec UDG suivie d’un clivage du site abasique dans des conditions alcalines (Fig. 7, à gauche), nous avons enregistré des rendements de clivage allant de 4% à 80% et des tendances claires se dégageant., Par exemple, l’efficacité de clivage augmente significativement avec l’augmentation de la longueur de la région contenant dU, dans l’ordre 10mer > 15mer > 20mer, avec un maximum de ~50% de clivage accessible pour une région dU 10mer dU, et 80% maximum pour la région dU 20mer dU. De même, des lieurs plus longs se traduisent par un taux de clivage global plus élevé. Ces observations indiquent que les séquences plus longues sont mieux reconnues et les bases uraciles correspondantes mieux excisées par UDG, ce qui suggère une plus grande accessibilité des substrats plus longs par l’enzyme., L’efficacité de clivage est également affectée par la quantité de nucléotides dU dans la partie clivable du substrat. En effet, les homopolymères d’uracile (100% dU) sont presque toujours moins clivés que leurs congénères avec des nucléotides du intercalés, et cet effet est particulièrement net lorsque les substrats sont synthétisés sur un linker T1 court. D’autre part, l’augmentation de la teneur en dU DE 12 à 50% est satisfaite avec une efficacité de clivage croissante, 50% DE dU semblant être la quantité optimale., Ainsi, dans nos conditions expérimentales, le clivage médié par UDG était le plus efficace sur les substrats les plus longs où la moitié des nucléotides de la partie clivable sont dU (efficacité de clivage de 80%). Cette tendance, ainsi que les données présentées à la Fig. 3, suggère que UDG peut reconnaître et se lier à de multiples incorporations dU, tant que dUs sont séparés par des nucléotides d’ADN canoniques.

bien que les homopolymères courts soient généralement connus pour être des substrats UDG pauvres, nous nous attendions également à observer de faibles taux de clivage pour les régions clivables 20mer, car de tels substrats sont peu susceptibles d’être trouvés dans L’ADN., In vivo, les bases uraciles se produisent principalement dans les brins D’ADN en raison d’une mauvaise incorporation pendant la réplication ou en raison de la désamination8,9 et il est peu probable que les deux processus se produisent à une fréquence aussi élevée pour former des homopolymères. Néanmoins, des efficacités de clivage modérées à élevées d’environ 60% ont été obtenues sur des homopolymères du 20mer long, mais il reste à déterminer si ces homopolymères sont traités plus lentement que les substrats à teneur en dU inférieure.

traiter une bibliothèque de réseaux D’ADN similaire avec le système enzymatique utilisateur (Fig., 7, à droite) conduit à un clivage satisfaisant des substrats monocaténaires, avec des tendances de clivage quelque peu comparables au cas UDG, mais à quelques exceptions notables. Premièrement, l’efficacité de clivage la plus élevée est inférieure à celle du système UDG/EDA (55% contre 80%, respectivement), ce qui peut être attribué à un traitement plus lent des sites abasiques avec L’endonucléase VIII par rapport à un traitement de base commun avec L’EDA., Deuxièmement, il semble y avoir une plus faible discrimination de longueur dans la région clivable par rapport à UDG/EDA, avec seulement 20-25% de différence au plus entre les régions courtes (10-nt) et longues (20-NT) contenant dU, Lorsque le traitement UDG seul a conduit à de grandes variations dans l’efficacité de clivage des mêmes 10 et 20mers (jusqu’à 50% de différence). Encore une fois, cet effet pourrait être dû à des différences dans le taux de traitement des sites AP. Enfin, les homopolymères dU semblent être dégradés dans la même mesure, indépendamment de l’éditeur de liens ou de la longueur du substrat., Cette absence de discrimination dans le cas de l’enzyme utilisateur et par rapport aux données de clivage médiées par L’UDG suggère que l’existence de plusieurs sites AP consécutifs est le facteur limitant dans l’élimination enzymatique des sites AP.

pour résumer, entre nos mains, nous avons constaté que les meilleures efficacités de clivage peuvent être obtenues avec le clivage médié par UDG suivi d’un traitement EDA sur des substrats plus longs et non homopolymériques contenant de l’uracile. Ce faisant, des séquences monocaténaires contenant 50% d’ua peuvent être efficacement clivées, mais en deux étapes., Un traitement court en une seule étape avec le cocktail enzymatique de l’utilisateur peut également cliver facilement jusqu’à 50% de brins simples contenant dU en une heure, cependant, le pouvoir discriminant apparemment plus faible de ce traitement enzymatique particulier peut être moins utile lorsqu’un clivage préférentiel est requis.