A DNS – gélelektroforézis a DNS-fragmensek méret szerinti elkülönítésére és azonosítására szolgáló technika.
a különböző méretű DNS-fragmenseket agarózból készült porózus gélbe töltik-ez a vörös algákban található szénhidrát.
elektromos mező alkalmazása esetén a fragmensek a gélen keresztül vándorolnak, a DNS-nukleotidok negatív töltésű foszfátcsoportjainak köszönhetően.
a kisebb DNS-darabok könnyebben vándorolnak át a gélen, mint a nagyobb fragmentumok, amelyeknek nehezebb ideje van a gél mátrixon keresztül mozogni.,
amikor a gélfutás befejeződött, a DNS-minták helyét összehasonlíthatjuk egy ismert méretű fragmensekkel vagy sávokkal, úgynevezett DNS-létrával.
A jelenléte a töredék kamat akkor erősíteni a mérete alapján, amely meghatározott összevetése alapján a relatív helyét a vizsgálati minta a töredékek a létra.
az agaróz géleket térfogatszázalékos oldat tömegével állítjuk elő. Tehát 1 gramm agaróz 100 ml pufferben 1% gélt eredményez., Az alacsonyabb százalékos gélek jobban megoldják a nagyobb töredékeket, a magasabb százalékos gélek pedig megkönnyítik a kisebb töredékek azonosítását. A gélkészítési eljárás elindításához mérje meg a megfelelő agaróz tömegét egy Erlenmeyer lombikba.
adjon hozzá futó puffert a lombikhoz úgy, hogy a puffer térfogata ne haladja meg a lombik kapacitásának 1/3-át. Ezután keverjük össze.
olvassa el az agaróz/puffer keveréket mikrohullámú sütőben történő melegítéssel, maximális teljesítmény mellett. Harminc másodpercenként távolítsa el a lombikot, majd forgassa el a tartalmát, hogy jól keveredjen. Ismételje meg, amíg az agaróz teljesen fel nem oldódik.,
Ezután adjunk hozzá etidium-bromidot 0, 5 mg/ml koncentrációhoz. Az etidium-bromid egy aromás vegyület, amely illeszkedik az egyes DNS-bázispárok vagy interkalátok közé, és a DNS intenzív narancssárga fluoreszcenciát bocsát ki UV fény alatt. Fontos megjegyezni, hogy az etidium-bromid karcinogén, ezért a vegyületet tartalmazó gélek kezelésekor mindig kesztyűt kell viselni.
a géltálca csavarodásának megakadályozása érdekében hagyja lehűlni az agarózt egy 65ºC-os vízfürdőbe helyezve.
ahogy az agaróz lehűl, készítse elő a gélformát úgy, hogy a géltálcát az öntőberendezésbe helyezi., Alternatív megoldásként szalagot használhat a géltálca nyitott széleinek lezárására az öntőforma létrehozásához. A fésű behelyezése a gélbe létrehozza azokat a kutakat, ahol a DNS betöltődik. Győződjön meg róla, hogy a fésű olyan kútot hoz létre, amely megfelelő méretű a DNS-mintához.
öntsük az olvadt agarózt a gélformába, és hagyjuk szobahőmérsékleten megkeményedni.
miután az agaróz megkeményedett, vegye ki a fésűt. Ha a gélt nem fogja azonnal felhasználni, csomagolja be műanyag csomagolásba, és használatig 4ºc-on tárolja.
Ha a gélt azonnal fel kell használni, helyezze a géldobozba.,
az eljárás megkezdéséhez adjon hozzá gél-betöltő festéket az elválasztandó DNS-mintákhoz. A betöltő festék általában 6x koncentrációban készül. A festék berakodása segít a minták vizualizálásában és a kutakba történő betöltésében, valamint segít meghatározni, hogy a minták milyen messzire vándoroltak a futás során.
állítsa a tápegységet a kívánt feszültségre.
most adjon hozzá elegendő futó puffert a géldobozba, hogy lefedje a gél felületét. Ügyeljen arra, hogy ugyanazt a futó puffert használja, mint a gél elkészítéséhez.
csatlakoztassa a géldoboz vezetékeit a tápegységhez, majd kapcsolja be., Ne feledje, hogy a DNS negatív töltésű, és mozog felé anód, ami pozitív, általában piros színű. Ügyeljen arra, hogy ne csatlakoztassa a fekete vezetéket vagy a katódot a géldoboz aljára. Tehát ne felejtsük el, ne feledje, hogy a fekete macskák balszerencse vagy negatívak, ezért a fekete katód negatív. Futtassa a gélt pirosra vagy az anódra. Annak ellenőrzésére, hogy mind a géldoboz, mind a tápegység működik-e; a buborékok megjelenése az elektródákon azt jelzi, hogy az áram áthalad.
távolítsa el a géldoboz fedelét., Lassan, óvatosan töltse be a DNS-mintákat a gélbe. A mintában lévő rakodófesték ismét lehetővé teszi, hogy a minta a gélbe süllyedjen, és segít nyomon követni, hogy a minta milyen messzire ment. A DNS-méretjelzőt vagy létrát mindig a kísérleti mintákkal együtt kell betölteni.
cserélje ki a fedelet. Ellenőrizze, hogy az elektródák be vannak-e dugva a tápegység megfelelő nyílásaiba.
kapcsolja be a készüléket. Futtassa a gélt, amíg a festék megfelelő távolságra nem vándorol.
amikor az elektroforézis befejeződött, kapcsolja ki a tápegységet, majd távolítsa el a géldoboz fedelét.,
távolítsa el a gélt a géldobozból, és engedje le a felesleges puffert a gél felületén. Helyezze a géltálcát papírtörlőre, hogy felszívja a fennmaradó futó puffert.
A DNS-fragmensek megjelenítéséhez vegye le a gélt a géltálcáról, és tegye ki a gélt ultraibolya fénynek.
A DNS-fragmentum narancssárga fluoreszkáló sávként jelenik meg. Készítsen egy képet a gélről.
a kísérlet végén intézményenként megfelelően dobja ki a gélt és a futó puffert. Az etidium-bromid expozíció elkerülése érdekében ne felejtse el mindig kesztyűvel kezelni a gélt és a futó puffereket.,
most, hogy látta, hogyan kell elvégezni a DNS-gél elektroforézist. Vessünk egy pillantást néhány downstream alkalmazások és változatai ezt a rendkívül hasznos módszer.
itt egy agaróz gél elektroforézis eredményt lát a PCR termékek elválasztása után. A gélbe betöltött DNS-fragmensek jól meghatározott sávokként láthatók. A DNS-szabványt vagy a létrát olyan mértékben kell elválasztani, amely lehetővé teszi a mintasávok méretének hasznos meghatározását. Ebben a példában, a DNS-töredékeket 765 bázispár, 880 bázis párok, 1022 bázispár egymástól 1.,5% agaróz gél 2-log DNS létrával.
az érdeklődésre számot tartó DNS-fragmentum jelenlétének megerősítése mellett a DNS-gél elektroforézis kombinálható gél tisztítási eljárásokkal. Jellemzően egy borotvapengével vágják ki az érdeklődésre számot tartó DNS-fragmentumot, hogy összegyűjthessék, és a benne lévő DNS-minta visszanyerhető legyen.,
az agaróz gélelektrofézis kombinálható a transzferblottálással is, amely magában foglalja a DNS vagy RNS átvitelét egy cellulózmembránba, ahol radioaktív szondák használhatók az elektroforetikusan elválasztott minta specifikus DNS-vagy RNS-szekvenciáinak azonosítására.
a Standard DNS gélelektroforézis nem ideális a 15-20 kb-nál nagyobb nagy molekulatömegű DNS elválasztására, mint például a genomikus DNS. A nagy DNS-minták elválasztásához impulzusmező gél-elektroforézist alkalmaznak, amely magában foglalja a gél különböző irányú változó vagy lüktető elektromos mezőnek való alávetését., Ez a technika egy speciális gélfutó készüléket foglal magában, amelynek elektródapárai különböző irányokba vannak elrendezve a gél körül. Ez lehet felismerni a különbségeket a genom méret lakosság között a szervezetek, mint az egyesített DNS-minták a különböző mikrobiális közösségek, itt lát, amelyeket különböző tó környezetben.
Ön most látott egy bevezetés a DNS gél elektroforézis., Megmutattuk a módszer mögött meghúzódó koncepciót, az agaróz gél elkészítésének módját, a minták betöltésének módját, a gél futtatásának módját, valamint az agaróz gél elektroforézis néhány gyakori alkalmazását. Köszönöm, hogy megnézted és sok sikert a géled futtatásához.