SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézis) a laboratóriumban a fehérjék molekulatömegük alapján történő elválasztására használják. Ez egyike azoknak a technikáknak, amelyeket általában használnak,de nem gyakran teljesen értettek. Próbáljuk meg helyrehozni.
SDS-PAGE elválasztja a fehérjéket molekulatömegük szerint, az alkalmazott elektromos mező hatására egy szitáló mátrixon (gélen) keresztül történő migráció differenciálsebessége alapján.,
A Fehérjemigráció sebességét a molekulatömeggel arányos
bármely töltött faj elektromos mezőn keresztüli mozgását nettó töltése, molekulasugara és az alkalmazott mező nagysága határozza meg. De a natív hajtogatott fehérjék problémája az, hogy sem a nettó töltésük, sem a molekuláris sugara nem függ molekulatömegtől. Ehelyett a nettó töltésüket az aminosav-összetétel határozza meg, azaz a fehérje pozitív és negatív aminosavainak összege és a molekuláris sugár a fehérje tercier szerkezete alapján.,
tehát natív állapotukban az azonos molekulatömegű fehérjék töltésüktől és 3D formájuktól függően különböző sebességgel vándorolnának egy elektromos mezőben.
külön fehérjék elektromos mező alapján a molekuláris súlya csak, akkor kell, hogy elpusztítsa a harmadlagos szerkezetét azáltal, hogy csökkenti a fehérje egy lineáris molekula, de valahogy maszk a lényegi nettó felelős a fehérje. Ez az, ahol SDS jön.,
az SDS (et al) szerepe
az SDS olyan mosószer, amely jelen van az SDS-oldal mintapufferben, ahol egy kis forralás mellett egy redukálószer (általában DTT vagy B-ME a fehérje-fehérje diszulfid kötések lebontására) megzavarja a fehérjék tercier szerkezetét. Ez a hajtogatott fehérjéket lineáris molekulákhoz vezet.
az SDS a fehérjét egyenletes negatív töltéssel is bevonja, amely elfedi az R-csoportok belső töltését. Az SDS meglehetősen egyenletesen kötődik a lineáris fehérjékhez (körülbelül 1.,4G SDS/ 1G fehérje), ami azt jelenti, hogy a fehérje töltése most megközelítőleg arányos a molekulatömegével.
SDS is jelen van a gélben, hogy megbizonyosodjon arról, hogy ha a fehérjék linearizálódnak, és a töltésük elfedi őket, akkor az egész futás során így maradnak.
az SDS-bevonatú fehérje meghatározásának domináns tényezője a molekuláris sugár., SDS-os fehérjék kimutatták, hogy a lineáris molekulák, 18 Egységnyi széles, a hossza arányos a molekuláris súlya, így a molekuláris sugár (így a mobilitás, a gél) határozza meg a molekulatömegű fehérje. Mivel az SDS-bevonatú fehérjék azonos töltési tömegaránnyal rendelkeznek,a töltésen alapuló differenciál migráció nem lesz.
A Gélmátrix
egy alkalmazott elektromos mezőben az SDS-vel kezelt fehérjék molekulatömegüktől függően különböző sebességgel mozognak a pozitív anód felé., Ezek a különböző mobilitások eltúlzottak lesznek a gél mátrix nagy súrlódási környezete miatt.
ahogy a neve is sugallja, az SDS-PAGE-hez használt gélmátrix a poliakrilamid, ami jó választás, mert kémiailag inert, és alapvetően könnyen elkészíthető különféle koncentrációkban, hogy különböző pórusméreteket készítsen, amelyek különféle elválasztási feltételeket biztosítanak, amelyek az Ön igényeitől függően megváltoztathatók. Emlékezhet arra, hogy korábban írtam egy cikket az akrilamid polimerizáció mechanizmusáról.,
A nem Folyamatos Puffer Rendszer, valamint az Egymásra Gél – Bélés Őket a rajtvonalnál
ahhoz, Hogy végezzen a jelenlegi a katód (negatív), hogy az anód (pozitív) keresztül a gél, egy puffer nyilvánvaló, hogy szükség van. Leginkább a nem folytonos Laemmli pufferrendszert használjuk. “Nem folytonos” egyszerűen azt jelenti, hogy a puffer a gél és a tartály különböző.
a rendszert általában egy 6,8 pH-os Stack géllel állítják be, amelyet Tris-HCl pufferol, Tris-HCl által 8,8 pH-ra pufferelt futó gélt és 8,3 pH-nál egy elektródpuffert., A stack gélben alacsony az akrilamid koncentrációja, a futó gélben pedig nagyobb a koncentráció, amely képes késleltetni a fehérjék mozgását.
Tehát mi van a különböző pH-kkal?
Nos, a glicin három különböző töltési állapotban létezhet, pozitív, semleges vagy negatív, a pH-tól függően. A glicin töltöttségi állapotának ellenőrzése a különböző pufferek által a kulcs az egész egymásra rakható gél dologhoz.,
így működik a stacking gél. Amikor a teljesítmény be van kapcsolva, a negatív töltésű glicin ionok a pH 8.3 elektródpufferben kénytelenek belépni a Halmozó gélbe,ahol a pH 6.8. Ebben a környezetben a glicin elsősorban zwitterionos (semleges töltésű) állapotba kapcsol. Ez a töltési veszteség nagyon lassan mozog az elektromos mezőben.
a Cl – ionok (a Tris-HCl-ből) viszont sokkal gyorsabban mozognak az elektromos mezőben, és ionfrontot képeznek, amely a glicin előtt vándorol., A szétválasztás a Cl – a Tris counter-ion (ami most felé az anód) létrehoz egy keskeny zóna, egy meredek feszültség gradiens, hogy húzza a glicin mentén mögött, ami a két szűken külön fronton vándorló ionok; a mobil Cl – elülső, majd a lassabb, többnyire semleges glicin előtt.,
a gélmintában lévő összes fehérje elektroforetikus mobilitással rendelkezik, amely köztes a glicin és a Cl-mobilitása között, tehát amikor a két front jól söpör át a mintán, a fehérjék a CL – és glicin frontok közötti szűk zónába koncentrálódnak.
és ki vannak kapcsolva!
Ez a menet addig folytatódik, amíg el nem éri a futó gélt, ahol a pH 8, 8-ra vált. Ezen a pH-n a glicin molekulák többnyire negatív töltésűek, és sokkal gyorsabban tudnak vándorolni, mint a fehérjék., Tehát a glicin front felgyorsul a fehérjék mellett, hagyva őket a porban.
az eredmény az, hogy a fehérjéket egy nagyon keskeny sávba dobják az egymásra rakható és futó gélek felületén, és mivel a futó gél megnövekedett akrilamid koncentrációval rendelkezik, ami lelassítja a fehérjék mozgását méretük szerint, megkezdődik az elválasztás.
miről szólt ez az egész?
Ha még mindig kíváncsi, hogy miért van szükség a Egymásra rakható gélre, gondoljon arra, mi történne, ha nem használna egyet.,
A Géllyukak körülbelül 1 cm mélyek, általában lényegesen meg kell tölteni őket, hogy elegendő fehérjét kapjanak a gélre. Tehát egy egymásra rakható gél hiányában a minta a futó gél tetején ülne, akár 1 cm mély sávként.
ahelyett, hogy összeállnának és együtt ütnék a futó gélt, ez azt jelentené, hogy a mintában lévő fehérjék különböző időpontokban lépnek be a futó gélbe, ami nagyon elkenődött sávokat eredményez.,
tehát az egymásra rakható gél biztosítja, hogy az összes fehérje egyszerre érkezzen a futó gélbe, így az azonos molekulatömegű fehérjék szűk sávokként vándorolnak.
elválasztás
miután a fehérjék a futó gélben vannak, elválasztják őket, mivel a nagyobb molekulatömegű fehérjék lassabban mozognak a porózus akrilamid gélen, mint az alacsonyabb molekulatömegű fehérjék. A gél pórusainak mérete az akrilamid koncentrációjának megváltoztatásával megváltoztatható a szétválasztani kívánt fehérjék méretétől függően. A tipikus értékeket az alábbiakban mutatjuk be.,
