pulmonalis evaluation. A tüdőfunkciós teszteket (PFT) Brentwood spirométerrel végeztük irodánkban. Néhány beteget máshol teszteltek.
Immunvizsgálatok. A vizsgálatokat immunológiai laboratóriumokban végezték A. Wojdani, Ph. D. irányítása alatt.. Tekintettel e vizsgálatok jelentőségére ezen értékelés összefüggésében, a módszertant részletesen ismertetjük.,
formaldehid-humán szérumalbumin (F-HSA) és formaldehid-szarvasmarha szérumalbumin (F-BSA) konjugátumok előállítása:
elektroforetikus és immunoelektroforetikus HSA, BSA és F-HSA és F-BSA összehasonlítást végeztek a konjugáció előfordulásának meghatározására. A konjugációt az F-HSA, F-BSA megváltozott mobilitása bizonyította, amikor a HSA-val vagy a BSA-val hasonlították össze. Ezenkívül az F-HSA-ban vagy az F-BSA-ban jelen lévő szabad amino-add csoportok számát Snyder és Sobocinski (1975) módszerével határozták meg, és a szubsztitúció mennyiségének felmérésére használták., A formaldehidhez kötött aminocsoportok száma a HSA esetében 26, a BSA esetében pedig 31 volt. Ebben a számításban figyelembe vették az intermolekuláris keresztkötés kialakulását.
toluol diizocianát-humán szérum albumin (TDI-HSA) és szarvasmarha szérum albumin (TDI-BSA) konjugátumok előállítása:
Ez a készítmény hasonló volt a Dewar és Baur (1982) módszereihez. E módszer szerint az 1G HSA-t vagy az 1g BSA-t 100 ml kálium-kloridot (0,05 mol/l), nátrium-borátot (0,05 mol/l), PH 9,4-et tartalmazó pufferoldatban oldottuk, majd 4 C-re hűtöttük.dioxán (10 ml), amely 0-t tartalmaz.,Ezután 15 ml toluol-diizocianátot adagoltunk cseppenként keverés közben 3 órán keresztül, majd hozzáadtunk 2 ml etanolamint, centrifugálást, dialízisszűrést és liofilizációt. Az F-HSA-hoz és az F-BSA-hoz hasonlóan a konjugációt elektroforézissel és a konjugátumban jelen lévő szabad aminocsoportok meghatározásával erősítették meg. A TDI-hez kötődő aminocsoportok száma a HSA esetében 37, a BSA esetében pedig 43 volt. Ezenkívül a konjugátum spektrografikus elemzését Zeiss et szerint végezték. al. (1980)., A felszívódás 230 nm-ről 260 nm-re nőtt, ami azt jelezte, hogy a TDI kovalensen kapcsolódik a fehérjehordozóhoz. Ez a növekedés a felszívódás egyetért, NH2 csoport meghatározása 76% – a HSA 81% – os BSA
Előkészítése trimellitic anhidrid-humán szérum albumin (TMA-HSA), valamint Trimellitic anhidrid szarvasmarha szérum albumint (TMA-BSA):
készíteni ezeket a konjugátumok 25 mg. a TMA-t 0,5 ml dioxánban oldottuk, és cseppenként 25 mg HSA-hoz vagy BSA-hoz adtuk, 5 ml hideg 7% NaHCO3-ban vízben oldva., 4 ° C-on 60 percig tartó keverés után a konjugátumokat négy, 0,1 M NaHCO3-as változás és egy puffercsere ellen dializáltuk. Végül a konjugátumokat szűrtük, és -20 C-on tartottuk, amíg nem használtuk. A TMA-HSA és a TMA-BSA OD analíziseit a megfelelő hordozófehérjéhez kapcsolódó TMA-maradékok számának meghatározására végezték. A hordozófehérje koncentrációját a HSA és a BSA molekulatömegével mólkoncentrációvá alakítottuk át. A TMA-ligandum moláris koncentrációjának és a fehérjehordozónak az arányából kiszámítottuk a TMA-maradékok arányát a hordozó molekuláihoz viszonyítva., A TMA-HSA becslések szerint 5 TMA maradékot tartalmaz HSA molekulánként, a TMA-BSA esetében pedig hét maradékot tartalmaz albumin molekulánként (Pien et al., 1988).
Előkészítése phthalic anhidrid-humán szérum albumin (PA-HSA), valamint Phthalic anhidrid szarvasmarha szérum albumint (PA-BSA) konjugátumok:
Ezek a hapten-konjugátumok készültek hozzáadásával 75 mg PA, hogy a lehűtött oldat 300 mg HSA vagy BSA 100 ml H2O. A reakció keverék volt, felkavarta egyik napról a másikra, dialyzed ellen, 0,1 M PBS segítségével tubings a cutoff 8000 dalton. A Zeiss et módszerével. al. (1977) kiszámították a mólarányt., A moláris arányokat a PA/HSA esetében 22/28-nak, a PA/BSA esetében pedig 25/30-nak találták.
benzolgyűrű HSA (B-HSA) és benzolgyűrű BSA (B-BSA) konjugátumok előállítása:
ezekre a készítményekre 40 mg. a P-aminobenzoesavat 2 ml 1 N HCL-ben oldottuk, majd jégfürdőbe merítve hűtöttük. Cseppenként 14 mg / ml hideg oldatot adtunk hozzá. Minden egyes hozzáadás után az elegyet 30 másodpercig keverjük. Ezzel párhuzamosan, egy gramm HSA vagy BSA feloldjuk bórsav 0.16 M nátrium-klorid (0-15 M) puffer PH 9.0 (PH neveltek fel, NaOH)., Az albuminok oldatait tartalmazó főzőpoharakat mágneses keverővel ellátott jégfürdő vette körül. A diazónium-só oldatát cseppenként adjuk hozzá, gyors keverés közben a hideg fehérjeoldathoz. Minden csepp hozzáadása után a PH-t egy normál NaOH-val 9,0-9,5-re állítjuk be. Amikor az összes oldatot hozzáadtuk, a reakciót lassú keverés mellett legalább egy órán át folytattuk a NaOH oldat további hozzáadásával, és a PH-értéket 9,0-9,5 tartományban tartottuk., A nem reagáló kis molekulákat kiterjedt dialízissel vagy a hideg helyiségben lévő sephadex G-25 oszlopon keresztül távolították el, izotóniás sóoldattal, mint eluáló puffert. A B-HSA és a B-BSA narancssárga színfejlődésének OD-elemzését a megfelelő hordozófehérjéhez kapcsolódó B-maradékok számának meghatározására végezték. A HSA B helyettesítésének összege körülbelül 41, a BSA 53 esetében pedig (Migrdichian, 1957).
antitest determináció:
az F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA és B-HSA elleni specifikus antitesteket nem kompetitív ELISA vizsgálattal elemezték., Kutak mikrotiter lemezek (Dynatech, Alexandria, VA) voltak bevonva 100 1 antigén oldatok (100 g/ml) 0,1 M PBS PH 7,2 egyik napról a másikra 4 C. lemezeket mossuk 4-szer 0,1 M PBS tartalmazó 0,05% tween 20 minden lépés között. A szabad felszívódási helyeket 2% – os proteázmentes szarvasmarha-szérum albuminnal blokkolták szobahőmérsékleten 4 órán keresztül, és -20 C-on tárolták használatukig.,
Analitikai Eljárás:
Az eljárás tartalmazza a következőket: (1) mosás négy alkalommal, (2) továbbá 100 1 hígított szérum (1:2 IgE, 1:100-IgM, majd IgG) a PBS-tween-20, 1% BSA (3) inkubációs 4 órán át 20 C-on, majd mossuk 4-szer, (4) ráadásul 100 1 optimális hígítás alkalikus foszfatáz jelölt érdeklődési tisztított kecske anti-human IgE ( ) (1:200), IgM (1:500), valamint anti-IgG (1:1000), vásárolt KPI (Maryland) (5) inkubációs 120 perc, 20 C-on, (6) mosás 6-szor, (7) kívül 100 1 a P-nitro-fenil-foszfát (Sigma Chemical Co.,) (8) inkubálás 60 percig 20 C (9) 50 1 3 N nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával és (10) kettős leolvasás mellett. Az eredményeket a mikrotiter olvasó segítségével 405 nm-es duplikált minták abszorpciói alapján számítottuk ki. Minden mintát egy HSA antigén ellen olvastak, mint az F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA és B-HSA-ra nem specifikus kötés kontrollját. Az eredményeket titerként fejeztük ki. A Titer a szérum utolsó hígítása, amely a HSA kontroll kétszeresére ad abszorbanciát.,
Specificitási és kereszt-gátlási vizsgálatok:
az antitest specificitás meghatározásához kereszt-gátlási vizsgálatot végeztek. A hapten-protein konjugátum pozitív szérumait megfelelő inkubálás és kicsapódás után, tízszeresére növekvő hapten-kötésű HSA vagy BSA inhibitorokként futtatták, hogy lefedjék az antigén felesleggel szembeni antitest-tartományt. Ez a tartomány a hapten-BSA esetében 50-1000 g, a hapten-RSA esetében pedig 80-1000 g között volt., Inkubálás után 37 C eltávolítása csapadék által a centrifugálás, a mintát előtt, illetve után cross-gátlás vizsgálat, majd elhelyezett lemezek wells bevonva az adott konjugált. A következő lépéseket az ELISA-vizsgálat során a fent leírtak szerint követték.
a különböző konjugátumokhoz kötődő IgG és IgM antitesteket a hapten-HSA vagy a hapten-BSA 36-85% – kal gátolta. Egy adott koncentrációban mind a hapten-HSA, mind a hapten-BSA hasonló módon gátolta az antitestszintet.,
az IgE antitest különböző hapten konjugátumokhoz való kötődésének részleges gátlását figyelték meg, amikor a szérumot hapten-HSA-val vagy hapten-BSA-val elő inkubálták. Az IgE-antitest gátlásának ez a hiányos megfigyelése elsősorban a laboratóriumunkban lévő különböző vegyi anyagokkal szemben magas IgE-titerű szérum elérhetetlenségével függött össze.,
az antitestek normál szintjének meghatározása (kontrollok):
a fenti eljárások alapján 160 egészséges, mindkét nemből származó, 22-55 év közötti vérdonor mintát vizsgáltak az F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA és B-HSA elleni antitestszintek tekintetében. Az átlagos titer az IgG esetében 1:800 400, az IgM esetében 1:3200 1600, az IgE esetében 1:8 4 volt. Így laboratóriumi titereinkben az IgG esetében az 1:1600-nál nagyobb, az IgM esetében az 1:6400, az IgE esetében pedig az 1:16-ot pozitívnak tekintik.,
egy adott betegnél az antitest-titerek több mint egy hígítással történő emelkedése vagy csökkenése szignifikánsnak tekinthető (lásd a táblázatokat).
limfocita alcsoport felsorolása:
egyetlen lézeráramú citométer (Epics profil: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL), amely megkülönbözteti előre és derékszögű fény szórás, valamint a két szín, használták a szoftver csomag (Quad Stat: csoroszlya). A mononukleáris sejtpopulációkat kétszínű, közvetlen immunfluoreszcenciával határozták meg, a megfelelő monoklonális antitest és áramlási citometria (Fletcher et al.,, 1989) a következő fluoreszcein izotiocianát (FITC) vagy phycoerythrin (PE) konjugált monoklonális antitesteket (Coulter immunológia) választottuk ki: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI és T11-FITC/Tal-pe a T-sejt/B sejt, T-helper/T-szuppresszor, NKHT3+ /nkhy3, illetve a limfocita aktiváció alternatív útja.
a limfocita markerek monitorozásához bat-térképeket állítottak fel az elülső szögű fényszórás lymphocyta populációjára, szemben egy 90 könnyű szórás hisztogrammal., Meghatároztuk az egyes markerpárokhoz tartozó pozitívan festett sejtek százalékos arányát, valamint a kétszeresen festett sejtek százalékos arányát. A becsült abszolút szám a limfociták pozitív az adott felszíni markerek által meghatározott szorozni perifériás limfocita sejtek száma a százalékos aránya pozitívan festett sejtek minden egyes marker pár. Ezenkívül meghatározták a kétszeresen festett sejtek százalékos arányát is., A becsült abszolút szám a limfociták pozitív az adott felszíni markerek által meghatározott szorozni perifériás limfocita sejtek száma a százalékos pozitív sejtek minden egyes felületi marker.
anti-mielin basic protein antitestek mérése:
A humán mielin basic protein (Hmbp)diebler et al. módszerrel készült. (1972) és poliakrilamin gél elektroforézissel ellenőrizték a tisztaságot. A hmbp-hez való antiserumot nyulakban HMBP ismételt befecskendezésével indukálták teljes Freund adjuvánsban., Antitest tevékenység a nyúl sera-s beteg minták volt kimutatható hozzáadásával eltérő hígítást (1:100 1:10,000) a sera, hogy wells egy microtiter lemez korábban bevont HMBP a következőképpen: HMBP 250 g/ml volt oldott karbonát puffer, PH 9.6 200 l ez a megoldás azt is hozzátette, hogy minden jól van. Inkubálás, mosás és blokkolás után 200 1 hígított nyúl vagy humán szérum került a kutakba. Inkubálás után I óra 37 ° C-on a szérumot ráztuk ki a kutakból, majd 5-ször mostuk mosóoldattal., 200 1 peroxidáz-konjugált kecske anti-nyúl vagy kecske anti humán IgG, IgM vagy IgA (optimális hígítás) adunk a megfelelő jól. Inkubálás és ismételt mosás után minden kúthoz 200 db ABTS hordozót adtak. A lemezeket szobahőmérsékleten egy órán át inkubáltuk, és 405 tun hullámhosszon mikrotiterolvasóban olvastuk. Nyúl antisera alkalmazásával; egy titrálási görbét ábrázoltak, és összehasonlították a beteg szérumát ezzel a standard görbével., Több mint 200 kontroll és a betegek mintájának meghatározása alapján az IgA esetében 1:2000-nél, IgM esetében 1:5000-nél, IgG esetében 1:8000-nél nagyobb litereket tekintettek pozitívnak.