Mi az áramlási citometria (FACS elemzés)?

eredetileg az 1960-as évek végén fejlesztették ki, az áramlási citometria egy népszerű analitikai sejtbiológiai technika, amely fényt használ a sejtek számolására és profilozására heterogén folyadékkeverékben. Az áramlási citometria különösen hatékony módszer, mivel lehetővé teszi a kutató számára, hogy gyorsan, pontosan és egyszerűen összegyűjtse az élő sejteket tartalmazó heterogén folyadékkeverékből származó számos paraméterre vonatkozó adatokat.,

az áramlási citometriát széles körben alkalmazzák az élet és az orvosbiológiai tudományok területén, és bármilyen forgatókönyvben alkalmazható, amikor a kutatónak gyorsan meg kell határoznia a laza sejtek nagy populációját folyékony közegben. Például az immunológiában a citometriát különböző immunsejt altípusok azonosítására, elkülönítésére és jellemzésére használják méretük és morfológiájuk alapján.

Ha további információkra van szükség, fluoreszcens színezékekkel jelölt antitestek, amelyek erősen specifikus sejtfelszíni antigének (pl., differenciálódási vagy CD-markerek csoportjai) felhasználhatók egy nagyobb csoporton belüli specifikus alpopulációk jobb azonosítására és elkülönítésére.

egy áramlási Citométerben

• a Mintasejteket egyenként egy keskeny csatornán vezetik át.
• a fény a csatorna sejtjeinek megvilágítására szolgál.
• egy sor érzékelő érzékeli azokat a fénytípusokat, amelyeket a sejtek megtörnek vagy kibocsátanak.
• az érzékelők által megszerzett adatokat összeállítják és integrálják, hogy átfogó képet alkossanak a mintáról.,

FACS Antitestek jelenleg alkalmazott Kutatási

a Különböző Típusú Fény használt citometria Kísérlet

áramlási citométer használ, megtört vagy a kibocsátott fény kell számolni, illetve azonosítani a sejtek. Tudjon meg többet az áramlási citometriai kísérletben használt különböző típusú fényekről a következő ábrákon.,

Előre Scatter

Előre szórt fény megtört egy sejt az áramlási csatorna, valamint továbbra is várjuk a fény útját (azaz ugyanabba Az irányba, hogy a fény eredetileg utazás). Az előre szórt fényt egy érzékelő érzékeli a fényútban, és jellemzően a részecskeméret azonosítására használják.

a szórt fényt leggyakrabban az objektum méretének észlelésére használják a fényútban., Nagyobb tárgyak többet termelnek előre szórt fény, mint a kisebb tárgyakat, valamint a nagyobb sejtek egy erősebb előre scatter jel

Oldalon Scatter

Oldalon szórt fény átmegy a megvilágosodás forrása az áramlási csatorna, a megtört a sejtek egy irányba, amely kívül esik az eredeti fény útját. Az oldalsó szétszórt fényt egy olyan érzékelő érzékeli, amely ortogonális az eredeti fényúthoz.,

az oldalsó szórt fényt általában arra használják, hogy meghatározzák a sejt granularitását és összetettségét a fényútban. A nagy mennyiségű belső komplexitású, nagy szemcsés sejtek, mint például a neutrofilek, több oldalszórt fényt és nagyobb oldalszórást eredményeznek, mint az alacsony granularitású és komplexitású sejtek.

fluoreszcencia emisszió

a fluoreszcens fényt fluoreszcens molekulák bocsátják ki egy kompatibilis hullámhosszú lézer gerjesztése után., Fénycső származhatnak természetes fluorescing anyagok, a sejtet, vagy származhatnak fluoreszkáló festékek vagy fluoreszcencia-jelölt antitest használt címkén egy adott szerkezet a sejt.

Multiparametric Analysis

a mock flow citometry dot-plot, plotting forward vs side-scattered from a population of leukocyták., A sejtpopulációkat valószínűsíthető identitásuk jellemzi:

D > D, nagyon kicsi elemek, alacsony előre – és oldalsó szórással.

L/M valószínű leukociták / monociták, kicsi vagy közepes sejtek, alacsony belső komplexitással / granularitással. Ezek a sejtek közepes előre szórt és alacsony oldalsó szórás jelintenzitást generálnak

G valószínű granulociták, nagy belső komplexitású/granularitású sejtek. Ezek a sejtek nagy előre – és oldalsó szórási jeleket generálnak.,

Míg egyes identitások lehet megerősíteni előre-oldalt-scatter profilok, címkézés, egy sejt-típus specifikus marker mindig biztosít nagyobb felbontású, bizonyosság, amikor profilalkotás összetett, heterogén populációk sejtek.

például a fenti ábrán egy kutató képes lehet különbséget tenni a granulociták és a limfociták között előre és oldalra szórt fény segítségével. Azonban a granulociták három osztálya (neutrofilek, bazofilek és eozinofilek) nagyon hasonló méretűek és szerkezetűek, hasonló fényszórási tulajdonságokkal rendelkeznek., Ebben az esetben a neutrofileket szelektíven fel lehet címkézni a neutrofil specifikus marker, például az ELANE kifejezése alapján.

FACS: az áramlási citometriai adatokon alapuló sejtek válogatása

az áramlási citometria és a fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás (FACS) kifejezéseket gyakran felcserélhetően használják. A gyakorlatban különbségek vannak a két módszer között.

A FACS az áramlási citometria származéka, amely kivételes fokú funkcionalitást ad. A FACS használatával a kutató fizikailag rendezheti a sejtek heterogén keverékét különböző populációkba.,

a fluoreszkáló színezékekkel jelölt, erősen specifikus antitestek alkalmazásával a kutató FACS-analízist végezhet, és ezzel egyidejűleg adatokat gyűjthet, és a mintát szinte korlátlan számú különböző paraméter alapján rendezheti.

egy FACS-kísérletben:

• előre-szórás, oldal-szórás és fluoreszcens adatok gyűjtésére kerül sor, mint a hagyományos áramlási citometriában.
• a felhasználó által megadott paraméterek információt nyújtanak arról, hogy a cellákat hogyan kell rendezni.
• ezen paraméterek alapján a FACS gép elektródát használ, hogy elektromos töltést alkalmazzon minden cellára.,
• az áramlási kamrából való kilépéskor az elektromágnesek a cellákat töltéssel külön edényekbe rendezik.

hogyan néz ki az áramlási citometriai adatok?

egy áramlási citometriai kísérletben minden sejt, amely áthalad az áramlási citométeren, és kimutatható, különálló eseménynek minősül.

továbbá minden típusú fény, amelyet az áramlási citométer detektál (előre-szórás, oldal-szórás, valamint a fluoreszcencia emisszió minden hullámhossza), saját egyedi csatornát kap., Az áramlási citometriai adatok egymástól függetlenül ábrázolják az egyes eseményeket, és minden egyes csatornán érzékelik a fény jelintenzitását.

citometria adatok általában képviselt két módon: histograms, amely intézkedés vagy hasonlítsa össze egyetlen paraméter, pedig pont-telkek, amely összehasonlítani, 2 vagy 3 paraméter egyszerre két – vagy három-dimenziós scatter-telek.

a hisztogram általában egy adott csatornán észlelt intenzitást ábrázolja egy tengely mentén, az ezen intenzitással észlelt események száma pedig egy külön tengelyen van., Egy adott intenzitással észlelt nagyszámú esemény jelenik meg a hisztogramon.

ezzel szemben egy pont telken minden esemény egyetlen pontként jelenik meg a scatter-telken. A különböző tengelyek mentén 2 különböző csatorna intenzitása (vagy 3 különböző csatorna egy három dimenziós telken) jelenik meg. A hasonló intenzitású események ugyanabban a régióban halmozódnak fel a scatter-telken.

a hisztogramok és a dot-telkek egyaránt különböző előnyökkel járnak az áramlási citometriai adatok elemzéséhez. Az adatok legmegfelelőbb ábrázolásának kiválasztása segíthet annak biztosításában, hogy egy teljes történetet egyszerű, érthető formátumban mondjon el.

A Dot-telkek és a hisztogramok nem zárják ki egymást, és a legbonyolultabb áramlási citometriai kísérletek több parcellát használnak fel gazdag, több parametrikus adatok megjelenítésére egy mintán.

sok esetben több mint három paramétert kell egyszerre ábrázolni., Ebben az esetben egy adatelemzési technika, az úgynevezett gating segíthet további felbontást és rugalmasságot biztosítani, lehetővé téve a paraméterek közel korlátlan mennyiségének egyszerre történő elemzését több különböző scatter-parcellán és hisztogramon keresztül.

Gate ad Állásfoglalást citometria Adatok

A rövid, kapuzási egy módszer kiválasztása sejtek egy citometria kísérlet, hogy elemezzem, több konkrét részlet., A Gating lehetővé teszi a kutató számára, hogy több információt gyűjtsön és jelenítsen meg a sejtek szubpopulációjáról, mint amennyit egy 2 – vagy 3-dimenziós pont-telken általában meg lehet jeleníteni.

A bating felbontást ad egy áramlási citometriás kísérlethez, és lehetővé teszi a közel korlátlan számú különböző paraméter (csatorna) egyidejű elemzését.

egy gated Flow citometriás kísérletben:

• a felhasználó egy vagy több csatornáról gyűjt áramlási citometriai adatokat egy pont-telken.
• a megszerzett adatok alapján a felhasználó egy kapudobozt rajzol, amely kiválasztja a cellák alpopulációját a további elemzéshez.,
• a kapun belüli cellák alpopulációja külön kiemelésre kerül más, alternatív csatornákból származó információkat megjelenítő parcellákon.

a kapuk hihetetlen rugalmasságot biztosítanak a citometria áramlásához, így akár egysejtes felbontást biztosítanak a kutató számára elérhető minden csatorna számára. Több gates lehet létrehozni egy egységes scatter-telek, gates lehet a “halmozott”, illetve kombinált (azaz Egy betelepített alpopuláció a sejtek zárt a csatornák 1 2 tovább lehet zárt csatorna 3 4 teszi lehetővé további sajátossága, mélyebb elemzés).,

A gating

A kompenzációról szóló megjegyzés

az egyik csatornából a másikba történő Átömlés hamisan pozitív azonosított jeleket okozhat. A Spillover az a művészi jel,hogy egy fluoreszkáló festék egy másik fluorofor csatornájában a relatív fényerő és a kibocsátási spektrum függvényében okozhat. Itt jön létre a kompenzáció. A kompenzáció olyan eljárás, amely elkülöníti a jelet egy adott csatornától az ugyanabban a kísérletben használt többi csatornától. FITC pl., kibocsátási csúcsa az elektromágneses spektrum zöld tartományában van. Ugyanakkor fluoreszkál a sárga csatornában is, ahol a PE fényt bocsát ki. Egyszerűen fogalmazva, a kompenzáció kivonja a FITC jelet a PE csatornából.

ezt a jelet a “rossz” csatornában kivonják az érdeklődő fluorofór által okozott jelből. A fenti mintában a zöld és a sárga komponens aránya egy adott gerjesztési hullámhosszon állandó a FITC esetében., Így a PE csatornában a nem specifikus sárga FITC jel mennyiségét a zöld csatorna méréséből lehet következtetni az állandó kompenzációs együtthatók segítségével. Ugyanez igaz a PE-ből a FITC csatornába történő átömlésre is.