Sajátossága, valamint a Hatékonyság az Uracil DNS-Glycosylase által Közvetített Strand Dekoltázs, hogy a Megkérdezett a Nagy Sorozat Könyvtárak

UDG-mediált uracil kimetszés, a kémiai AP oldal dekoltázs a microarrays

– e DNS hasítás által közvetített UDG áll, két külön lépésben: kimetszés az uracil bázis követi a dekoltázs, a létrejövő abasic oldalon. A két lépés külön ellenőrizhető a DNS mikroarrays-on., Először is, abasic oldalak által generált kezeli a tömb UDG, majd egy második lépés, strand, a mély dekoltázs az okozta, hogy kiteszik a felület, sisakok, DNS oligonucleotides tartalmazó abasic oldalak vagy savas vagy lúgos körülmények között, vagy párolgó a felületet szárazra. A DNS-szálakon lévő abazikus helyek hasítására irányuló ilyen kémiai stratégiák kiküszöbölik a további enzimatikus hasítás szükségességét, és lehetővé teszik az UDG kinetika önálló vizsgálatát., Ebből a célból a 30meres DNS-szekvenciák tömbjeit, amelyek növekvő számú nem egymást követő dU-incorporációval (dU1 – dU9) készültek, maszkless nukleinsav fotolitográfiával szintetizálták, a megfelelő fényérzékeny dU foszforamidit (Fig. 2). Minden DNS-szálat egy dt15-linkerrel szintetizáltunk az üvegfelületre, majd az 5′ – végén egy 25meres hibridizációs célszekvenciával (QC25) végződtünk, amint azt az ábra mutatja. 3.,

az összes szonda szekvencia helyét a dU nukleotidok helyett a DT-t hordozó megfelelő replikátumokkal és kontrollszálakkal együtt randomizálták a mikroarray felületen., Az enzimes feldolgozás előtt a DNS-szondaszekvenciákat hibridizáltuk a Cy3-címkével ellátott kiegészítő 25mer oligonukleotiddal (QC25c) a kezdeti fluoreszcencia intenzitási értékek meghatározása érdekében. A 3 ‘ – Cy3 címkét arra használták, hogy megakadályozzák az esetleges fluoreszcencia leleteket a festék és a dus46 változó száma közötti kölcsönhatások miatt. A microarrays voltak kitéve a kereskedelmi forgalomban forrású UDG E. coli, valamint a abasic oldal dekoltázs ezt követően elvégzett különböző körülmények között. Az optimális enzim expozíciós időt a kezdeti kísérletekben határoztuk meg. Eredményeink (ábra., S1) azt mutatják, hogy az enzim hozzáadása után a hasítási hatékonyság jelentősen megnő az idő múlásával, akár egy óráig is, elérve a nagyjából 50-60% – os hatékonyságot, csak enyhe változásokkal az UDG további expozíciója után. Így az optimális expozíciós időt egy órára állítjuk be. Ezenkívül adataink egyértelműen megnövelik a hasítási hatékonyságot a dU növekvő számával, 40-60% – kal (füge. 3C és S1).

ezután továbbmentünk, hogy megvizsgáljuk a tényleges hasítási lépést, az abasic hely eltávolítását az uracil bázis kivágása után., Következő ismert stratégiák kémiailag indukált abasic oldal dekoltázs a solution20,30, a kapott AP-oldalak voltak akkor hasított vagy alatt lúgos körülmények által merítik a tömbök egy 1:1 (v/v) megoldás az etilén-diamin(EDA)/etanol, vagy a tömbök kezelték alatt savas körülmények által merítik a 30% – os (v/v) megoldás triklór-ecetsavas a diklór-metán, vagy párolgó a felszínen a sor, hogy a szárazra. Minden módszernél a kezeléseket különböző időtartamokon végezték, 1-24 óráig., Ezt követően a tömböket a Cy3-címkével ellátott kiegészítő 25mer oligonukleotidhoz (QC25c) viszonyították, és a kapott fluoreszcencia intenzitást összehasonlították az UDG-kezelés előtt kapott intenzitással a hasítási hatékonyság meghatározása érdekében. A kapott hasítási arányokat az ábra mutatja. 4.

alapvető feltételek mellett (ábra). 4B), az AP helyek hasítása minimális inkubációs időt igényel 2 óra annak érdekében, hogy megfigyeljék a szubsztrátok jelentős hasadását (40-60%). Azonban a tömb savval történő kezelése vagy felületének szárítása (ábra)., 4A, C) csak egy óra elteltével (savas kezeléssel 30-80%) tiszta és kiterjedt hasadást eredményez, amikor az EDA által közvetített abazikus hasítás minimális egy óra elteltével. Valószínű, hogy maga a hasítási reakció az A és C módszerekben a végső hibridizációs szakaszban elősegíti, akár hőmérséklet, akár amin jelenléte miatt a pufferben., Ennek ellenére, mivel a hibridizáció közös, hogy mindhárom módszer, a nagy különbségek a dekoltázs kinetikai közötti alapvető, illetve a nem-alapvető kezelések tippek a lehetőségét, hogy további AP helyek előállítható jelenlétében savas, vagy csökkentett nyomáson, így további pozíciókat a DNS-szál, amelyen a következő hasadási reakció léphet fel. A hosszabb kezelések, a módszertől függetlenül, nem változtatják meg jelentősen a hasítás mértékét, általában 40% – ról 80% – ra közelítik meg a dU incorporations számától függően., Valójában a hasítási hatékonyság egyértelmű általános növekedését látjuk, egyre több du-beépítéssel, minden vizsgált körülmények között.

amellett, hogy a kémiailag indukált DNS-szál hasítását abazikus helyszínen végezték, megvizsgálták a mikroarray felület minőségét. Ebből a célból a tömb felületeinek egységességét fluoreszcens intenzitások alapján vizuálisan megvizsgálták, és a nem törhető vezérlőszálak fluoreszcenciájának csökkenését figyelték meg., Azt találtuk, hogy abasic oldal dekoltázs alatt lúgos körülmények engedélyezett egyedi, enzim által közvetített hasítása dU tartalmazó szekvenciák de maradt a vezérlő szekvenciák, szinte érintetlen, mivel a savas körülmények között, DNS-szál dekoltázs is megfigyelték a vezérlő szál hiányzik uracil nukleotidok (Fig. S2). A felület szárítása a csak dT vezérlőszálak lebomlásához is vezetett. Mivel csak a lúgos körülmények között történő abázisos hasítás kerüli a felület lebomlását és a DNS nem specifikus elvesztését, minden későbbi kísérletet elvégeztünk ilyen körülmények között., Ez biztosítja, hogy a nem hasítható kontroll szekvenciák hosszú kémiai kezelés után is rendelkezésre álljanak összehasonlításra.

az Egyszeri, dupla szálú UDG sorrend függőség

Mivel az eredmények E. coli UDG-mediált dU dekoltázs szállított csak mérsékelt dekoltázs hatékonyság a DNS-szál tartalmazó egységes dU incorporations (≈40%), kihallgattunk a sorozat sajátossága UDG annak érdekében, hogy potenciálisan azonosítani egy erősen hasított dU tartalmazó hordozó. Erre a célra egy kettős és egyszálú DNS-szekvenciákból álló du – tartalmú nukleinsav-könyvtárat terveztünk., A könyvtár áll egy 7mer permutálható szekvencia egyetlen dU közepén (ábra. 5). Permutáció a 3 – nt szegélyező régiók, 5″ -, valamint 3 ” a dU eredmények 4096 egyedi szekvenciák. A kettős szálú formában egy hurok, valamint a 7mer kiegészítő sorozata került hozzáadásra, ami egy hajtűszerkezet kialakulásához vezetett. A hajtű szárában lévő további DG·dC bázispárok hozzájárultak a hajtű DNS szerkezetének olvadási hőmérsékletének növeléséhez. Ezeket az alappárokat az egyszálú szubsztrátokhoz adták annak érdekében, hogy az ssDNA és a dsDNA minták a lehető legszorosabban megmaradjanak., Végül egy 25mer oligonukleotidot adtak az egyes minták 5′-végéhez, hogy hibridizációs célként szolgáljanak. A szekvencia minták reprezentatív alakja az ábrán látható. 5.

Bár terminál címke a DNS-t, egy fluoreszcens festékkel egy kényelmes módszer, hogy közvetlenül intézkedés fluoreszcencia intenzitás, viszi a hátránya a magas fluoreszcencia zaj, mely különösen a nagy sűrűségű, nagy microarrays, tesz adatok kinyerése, az értelmezés nehezebb. Ezért úgy döntöttünk, hogy a hasítási reakciót hibridizációval figyeljük az immobilizált szekvenciákra., Az UDG – kezelés előtt az egy-és kettős szálú DNS-szubsztrátokat hibridizálták a jelzett komplementer 25mer oligonukleotiddal, majd a kezdeti fluoreszcencia értékek elérése érdekében megvizsgálták. Ezután a mikroarraysokat különböző időszakokban UDG-nek tették ki. A következő, lúgos körülmények között végzett AP-lokális hasítás után a tömböket újra hibridizálták a Cy3-címkével ellátott kiegészítéseikhez. A DNS-szálak fluoreszcencia jelének csökkenése a kezelés előtti fluoreszcencia értékekhez képest közvetlenül megfelel a hasítási hatékonyságnak., Az UDG 2 perces inkubálása után a kettős szálú szubsztrátok esetében a maximális hasítási hatékonyság körülbelül 40% volt, az egyszálú szubsztrátok esetében pedig kissé alacsonyabb hasítási Arány (S1 táblázat). Ez az alacsonyabb sebesség egyszálú ellentmond korábbi tanulmányok, jelezve, hogy ők hasított gyorsabb, mint a kettős szálú equivalents13,47,48. Érdekes módon a nagyon rövid enzim inkubációk (<1 perc) továbbra is jelentős hasítási hatékonysághoz vezetnek (30-35%)., Ezek a rövid időpontok különösen érdekesek, mivel egyértelmű utalásokat adnak a lehetséges szekvencia-preferenciákról. Annak érdekében, hogy azonosítsuk a szekvenciafüggést az UDG által közvetített DNS-degradációban a 4096 egyedi szálból, az 1% – ra összpontosítottunk (ábra. 6) valamint 5% (ábra. S3) a legtöbb és legkevésbé hasított részhalmaza szekvenciák. Reprezentatív szekvencia motívumok generált e szekvencia részhalmazok ábrán látható. 6 és a kiegészítő információk.,

a kettős szálú DNS-hez (ábra. 6A, B), Az eredmények azt mutatják, egyértelmű UDG szekvencia előnyben G / C-gazdag régiók szegélyező uracil. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy az UDG rosszul feldolgozza a t * a bázispárokat tartalmazó kettős szálú szubsztrátumokat. A jobb és szegényebb UDG-szubsztrátumokból kivont motívumok részben összhangban vannak a nagyon korlátozott, létező szakirodalmi adatokkal48, 49, 50. Seibert et al., feltételezések szerint az E. coli UDG hatékonysága összefügg a DNS hajlításának energetikai költségével, valamint a specifikus károsodások felismerésének folyamatában bekövetkező torzulással. A molekuladinamikai szimulációk alatt megoldódott fluoreszcencia kísérletek a két uracil-tartalmú kettős szálú DNS-szekvenciák, ők megállapították, hogy a hatékony hajlító erő állandók alacsonyabb, ha dAs vagy dTs található, a szomszédos, hogy az uracil nukleotid, ahelyett, hogy főigazgatóság, valamint dCs; ami arra utal, hogy dA/dT-gazdag szekvenciák talán könnyebben hajlított által UDG és így jobb processed49., Mivel az egyszálú DNS a DNS sokkal rugalmasabb formája,a szakirodalomban jelentett gyorsabb feldolgozása a szubsztrátok hasításának alacsonyabb energetikai költsége lehet,amely természeténél fogva rugalmasabb,mint a dsDNA7, 47, 49, 51. Hajlító azonban nem lesz döntő tényező, UDG dekoltázs sajátossága ssDNA, az enzim felismerve, valamint hasító minden szubsztrátok ugyanolyan jól, ami talán megmagyarázza, a hiánya sorrend konszenzus dU-tartalmú ssDNA., Mindazonáltal feltételezték, hogy a szekvencia-kontextus hatásai továbbra is kiterjednek az egyszálú DNS-re, és valóban megfigyelték az UDG-t a herpes simplex vírus 152-es típusából, de még mindig nem tisztázott az emberi vagy az E. coli UDG esetében. Slupphaug et al. a humán UDG szekvencia specificitását 34 dsDNA szekvencia kontextusban mértük, és feltételeztük, hogy a DT 3 ‘ – dU mindig lassú eltávolítást eredményez, mint a magas GC tartalom50. Eftedal et al. a borjú thymus és az E. coli UDG hasítási hatékonyságát 41 dsDNS-szekvenciából értékelték, és hasonló mintát találtak., A mi mérhetetlenül nagyobb sor szekvenciák, tudjuk egyetérteni, hogy dT 3 “dU mindig eredményez lassú eltávolítása, de az adatok egyértelműen azt mutatja, hogy a dC, dG kisebb mértékben, 3” dU eredményez gyors eltávolítása. Nem tudtuk azonosítani jelentős szekvencia függőség dU kivágás ssDNA (ábra. 6C, D). Meg kell jegyezni, hogy a szekvencia-függőség a dsDNS szubsztrátokban egyértelmű a rövid enzimatikus kezelésekhez (5s, 30s, 60s, and 120S), de lassan elhalványul a hosszabb UDG expozíció (30min) miatt, jelezve, hogy az összes szubsztrát végül hasad, amikor az enzimnek van kitéve.,

Dekoltázs honlap optimalizálás

Mivel nem szignifikáns sorrend függőség az UDG-mediált uracil kimetszés az egyszálú DNS kiemelkedett a vizsgálatok inkább mérsékelt dekoltázs hatékonyság egyetlen dU incorporations kapott, úgy döntött, hogy tanulmányozza UDG-mediált dU kimetszés, a hosszabb egyszálú szubsztrátok tartalmazó különböző formái több dU incorporations, amelynek célja az azonosítására szolgáló egyedi dekoltázs webhelyeket, amelyek könnyen enzimesen hozzáférhető, valamint lehetővé teszik a gyors, hatékony strand dekoltázs., Indokunk az, hogy a szonda távolságának növelése a felületről nagyobb hozzáférhetőséget biztosít a hasításhoz, de ez a hatás nem terjedhet át a hosszú távtartókra (>20-nt)53. Az eredmények alapján a Fig. 3, arra is számítunk, hogy a dU-nukleotidok nagyobb száma nagyobb általános hasadást eredményez, de azon gondolkodunk, vajon van-e optimális sűrűsége a DU-nukleotidoknak a DNS-szál hasítható részén. Ezért a hosszabb dU homopolimerek (10, 15 és 20mer), valamint a változó dU összetételű oligomerek uracil hasítását vizsgáltuk., A százalékos dU belül az oligomer volt viszonyítva számítják ki, a másik négy nukleotid (dA, dC, dG, valamint dT), illetve kísérletileg által elért végző csatlakozó reakciók előre vegyes megoldások a dU/dA/dC/dG/dT phosphoramidites különböző arányok (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 vagy 100:0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). A különböző hosszúságú poly-dT linkerekre (dT1, dT5, dT10 és dT15) épülő szekvenciákat, majd a dU-tartalmú régiót hibridizációs célokra 25mer célszekvenciával fejezték be, az ábra szerint. 7.,

a szintézist követően a 25mer hibridizálódott a komplementer 5′-Cy3 jelzésű oligonukleotidjával, és a mikroarrt 1 órán keresztül UDG-nak volt kitéve., Ezután az abasic hely hasítását lúgos körülmények között hajtották végre,majd egy végső rehibridizációt. Ezzel párhuzamosan elvégeztük a hasítási vizsgálatot a felhasználói enzimmel is, amely ebben az esetben kiküszöböli a további abazikus hely hasítási eljárás szükségességét.

Az UDG-vel végzett enzimvizsgálatra, majd lúgos körülmények között abazikus hasításra (1.ábra). 7, balra), 4% – tól 80% – ig terjedő hasítási hatékonyságot rögzítettünk, egyértelmű tendenciákkal., Például a hasítási hatékonyság jelentősen növekszik a dU-tartalmú régió hosszának növekedésével, a 10mer > 15mer > 20mer sorrendben, legfeljebb ~50% hasítással elérhető egy 10mer dU régióban, a 20mer dU régióban pedig legfeljebb 80%. Hasonlóképpen, a hosszabb bélések összességében magasabb hasítási arányt eredményeznek. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a hosszabb szekvenciákat jobban felismerik, a megfelelő uracil bázisokat pedig az UDG jobban kivágja, ami viszont azt sugallja, hogy az enzim jobban hozzáférhetővé teszi a hosszabb szubsztrátumokat., A hasítási hatékonyságot befolyásolja a du nukleotidok mennyisége is a szubsztrátum hasítható részén. Valóban, uracil homopolymers (100%dU) szinte mindig kevesebb, hasított, mint a rokon a tarkított dU nukleotidok, de ez a hatás különösen nyilvánvaló, amikor a szubsztrátok vagy szintetizált egy rövid T1 linker. Másrészt a dU-tartalom 12% – ról 50% – ra történő növelése a hasítási hatékonyság növelésével érhető el, az 50% dU pedig az optimális mennyiségnek tűnik., Így kísérleti körülmények között az UDG által közvetített hasítás volt a leghatékonyabb a leghosszabb szubsztrátumokon, ahol a hasítható rész nukleotidjainak fele dU (80% hasítási hatékonyság). Ez a tendencia, valamint az ábrán látható adatok. 3, azt sugallja, hogy UDG képes felismerni és kötődni több dU incorporations, mindaddig, amíg dUs elválasztjuk kanonikus DNS nukleotidok.

míg a rövid homopolimerek általában rossz UDG szubsztrátokról ismertek, arra számítottunk, hogy a 20mer hasítható régiók alacsony hasadási arányát is megfigyeljük, mivel az ilyen szubsztrátok valószínűleg nem találhatók a DNS-ben., In vivo az uracil-bázisok elsősorban a DNS-szálakban fordulnak elő a replikáció során vagy a deamináció miatt8, 9 és mindkét folyamat valószínűleg nem fordul elő ilyen nagy gyakorisággal homopolimerek kialakulásához. Ennek ellenére a hosszú 20mer dU homopolimerek esetében körülbelül 60% – os, közepes vagy magas hasítási hatékonyságot értek el, de még meg kell vizsgálni, hogy ezeket a homopolimereket lassabban dolgozzák-e fel, mint az alacsonyabb %dU tartalmú szubsztrátumokat.

hasonló DNS-tömb könyvtár kezelése a felhasználói enzimrendszerrel (ábra., 7, jobb) az egyszálú szubsztrátok kielégítő hasadásához vezet, a hasítási tendenciák kissé hasonlóak az UDG esethez, de néhány figyelemre méltó kivétellel. Először is, a legnagyobb hasítási hatékonyság alacsonyabb, mint az UDG/EDA rendszernél (55%, szemben a 80% – kal), ami az Abazikus helyek lassabb feldolgozásának tulajdonítható az endonukleáz VIII-val szemben az EDA-val végzett közös alapkezeléshez képest., Másodszor, úgy tűnik, hogy az UDG/EDA-hoz képest gyengébb hosszúságú megkülönböztetés tapasztalható a hasítható régióban, legfeljebb 20-25%-os különbséggel a rövid (10-nt) és a hosszú (20-nt) dU-tartalmú régiók között, amikor az UDG-kezelés önmagában nagy eltéréseket eredményezett ugyanazon 10 és 20mer hasítási hatékonyságában (akár 50% – os különbség). Ez a hatás ismét az AP webhelyek feldolgozási sebességének különbségeiből eredhet. Végül úgy tűnik, hogy a dU homopolimerek ugyanolyan mértékben bomlanak le, függetlenül a linker vagy a szubsztrát hosszától., Ez a megkülönböztetés hiánya a felhasználói enzim esetében és az UDG által közvetített hasítási adatokhoz képest arra utal, hogy az AP-helyek enzimatikus eltávolításának korlátozó tényezője a többszörös, egymást követő AP-helyek megléte.

összefoglalva, a kezünkben azt találtuk, hogy a legjobb hasítási hatékonyság érhető el az UDG által közvetített hasítással, amelyet az EDA kezelés követ hosszabb, nem homopolimer uracil tartalmú szubsztrátokon. Ennek során az 50% dU-t tartalmazó egyszálú szekvenciák hatékonyan hasíthatók, bár két lépésben., Egy rövid, egylépcsős kezelés a felhasználói enzimkoktéllal egy óra alatt akár a dU-tartalmú egyetlen szálak 50% – át is kényelmesen hasíthatja, azonban ennek az enzimatikus kezelésnek a látszólag alacsonyabb diszkrimináló ereje kevésbé hasznos lehet, ha kedvezményes hasításra van szükség.