Originariamente sviluppato alla fine del 1960, la citometria a flusso è una tecnica di biologia cellulare analitica popolare che utilizza la luce per contare e profilare le cellule in una miscela fluida eterogenea. La citometria a flusso è un metodo particolarmente potente perché consente a un ricercatore di raccogliere rapidamente, accuratamente e semplicemente dati relativi a molti parametri da una miscela fluida eterogenea contenente cellule vive.,
La citometria a flusso è ampiamente utilizzata per tutta la vita e le scienze biomediche e può essere applicata in qualsiasi scenario in cui un ricercatore ha bisogno di profilare rapidamente una grande popolazione di cellule sciolte in un mezzo liquido. Ad esempio, in immunologia la citometria a flusso viene utilizzata per identificare, separare e caratterizzare vari sottotipi di cellule immunitarie in virtù delle loro dimensioni e morfologia.
Quando sono richieste informazioni aggiuntive, gli anticorpi etichettati con coloranti fluorescenti e sollevati contro antigeni di superficie cellulare altamente specifici (ad es., cluster di differenziazione o marcatori CD) possono essere utilizzati per identificare e segregare meglio specifiche sottopopolazioni all’interno di un gruppo più ampio.
In un citometro a flusso
- Le cellule del campione vengono fatte passare attraverso un canale stretto uno alla volta.
- La luce viene utilizzata per illuminare le celle nel canale.
- Una serie di sensori rileva i tipi di luce che vengono rifratti o emessi dalle cellule.
- I dati acquisiti dai sensori vengono compilati e integrati per costruire un quadro completo del campione.,
FACS Anticorpi attualmente utilizzato per la Ricerca
- collezioni(1)
- (1)
- collezioni(1)
- (2)
- collezioni(1)
- collezioni(1)
- collezioni(3)
- (8)
- collezioni(1)
- collezioni(1)
- collezioni(6)
- (6)
- collezioni(2)
- (6)
- collezioni(2)
Diversi Tipi di Luce utilizzata in Citometria a Flusso Esperimento
Un citometro a flusso utilizza rifratta o la luce emessa il conteggio e l’identificazione delle cellule. Scopri i diversi tipi di luce utilizzati in un esperimento di citometria a flusso nelle figure seguenti.,
Dispersione in avanti
Dispersione in avanti
La luce diffusa in avanti viene rifratta da una cella nel canale di flusso e continua lungo il percorso della luce (cioè nella stessa direzione in cui la luce era originariamente in viaggio). La luce diffusa in avanti viene rilevata da un sensore nel percorso della luce e viene tipicamente utilizzata per identificare la dimensione delle particelle.
La luce diffusa in avanti è più comunemente utilizzata per rilevare la dimensione dell’oggetto nel percorso della luce., Gli oggetti più grandi producono più avanti, la luce diffusa di oggetti più piccoli, e grandi cellule è più avanti di segnale di dispersione
Dispersione Laterale
Dispersione Laterale
Lato sparsi in luce la luce passa dalla sorgente di illuminazione nel flusso del canale, viene rifratta dalle cellule in una direzione che è al di fuori dell’originale percorso della luce. La luce diffusa lateralmente viene rilevata da un sensore ortogonale al percorso della luce originale.,
La luce diffusa lateralmente viene solitamente utilizzata per determinare la granularità e la complessità della cella nel percorso della luce. Le cellule altamente granulari con una grande quantità di complessità interna, come i neutrofili, produrranno più luce laterale diffusa e un segnale di dispersione laterale più elevato rispetto alle cellule con una bassa granularità e complessità.
Emissione di fluorescenza
Emissione di fluorescenza
La luce fluorescente viene emessa da molecole fluorescenti dopo l’eccitazione da un laser a lunghezza d’onda compatibile., La luce fluorescente può provenire da materiali fluorescenti naturali nella cellula o può provenire da coloranti fluorescenti o anticorpi marcati a fluorescenza che sono stati utilizzati per etichettare una struttura specifica sulla cellula.
Analisi multiparametrica
Analisi multiparametrica
Un puntino di citometria a flusso finto, che traccia in avanti vs side-sparpagliato da una popolazione di leucociti., Le popolazioni cellulari sono contrassegnate dalla loro probabile identità:
D Presunti detriti, oggetti molto piccoli con bassa bassa dispersione in avanti e laterale.
L / M Probabili leucociti / monociti, cellule da piccole a medie con bassa complessità/granularità interna. Queste cellule generano un medio forward-scatter e bassa intensità del segnale side-scatter
G Granulociti probabili, grandi cellule con elevata complessità/granularità interna. Queste celle generano alti segnali di dispersione in avanti e laterale.,
Mentre alcune identità possono essere confermate da profili forward e side-scatter, l’etichettatura con un marker specifico di tipo cellulare fornisce sempre maggiore risoluzione e certezza quando si profilano popolazioni eterogenee complesse di cellule.
Ad esempio, nella trama sopra, un ricercatore può essere in grado di distinguere tra granulociti e linfociti usando luce diffusa in avanti e laterale. Tuttavia, tre classi di granulociti (neutrofili, basofili ed eosinofili) sono molto simili per dimensioni e struttura, dando loro proprietà di dispersione della luce simili., In questo caso, i neutrofili potrebbero essere etichettati selettivamente in virtù della loro espressione un marcatore specifico dei neutrofili come ELANE.
FACS: Ordinamento delle cellule basato sui dati della citometria a flusso
I termini citometria a flusso e ordinamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) sono spesso usati in modo intercambiabile. In pratica, ci sono differenze tra i due metodi.
FACS è un derivato della citometria a flusso che aggiunge un eccezionale grado di funzionalità. Utilizzando FACS un ricercatore può ordinare fisicamente una miscela eterogenea di cellule in diverse popolazioni.,
Utilizzando anticorpi altamente specifici etichettati con coloranti fluorescenti, un ricercatore può eseguire analisi FACS e contemporaneamente raccogliere dati su, e ordinare un campione da un numero quasi illimitato di parametri diversi.
In un esperimento FACS:
- Vengono raccolti dati forward-scatter, side-scatter e fluorescenti, come nella citometria a flusso convenzionale.
- I parametri definiti dall’utente forniscono informazioni su come ordinare le celle.
- Sulla base di questi parametri, la macchina FACS utilizza un elettrodo per imporre una carica elettrica su ogni cella.,
- All’uscita dalla camera di flusso, gli elettromagneti ordineranno le celle per carica in vasi separati.
Che aspetto hanno i dati della citometria a flusso?
In un esperimento di citometria a flusso, ogni cellula che passa attraverso il citometro a flusso e viene rilevata sarà classificata come un evento distinto.
Inoltre, ogni tipo di luce che viene rilevato dal citometro a flusso (forward-scatter, side-scatter, e ogni lunghezza d’onda di emissione di fluorescenza) sarà assegnato il proprio canale unico., I dati di citometria a flusso tracceranno ogni evento in modo indipendente e rappresenteranno l’intensità del segnale della luce rilevata in ciascun canale per ogni evento.
I dati di citometria a flusso sono tipicamente rappresentati in due modi: istogrammi, che misurano o confrontano solo un singolo parametro, e grafici a punti che confrontano 2 o 3 parametri contemporaneamente su un grafico a dispersione bidimensionale o tridimensionale.
In genere un istogramma traccia l’intensità rilevata in un singolo canale lungo un asse e il numero di eventi rilevati a tale intensità si trova in un asse separato., Un gran numero di eventi rilevati ad una particolare intensità verrà visualizzato come un picco sull’istogramma.
Al contrario, in un grafico a punti, ogni evento è rappresentato come un singolo punto su un grafico a dispersione. Intensità di 2 canali diversi (o 3 canali diversi in un grafico tridimensionale) sono rappresentati lungo i vari assi. Gli eventi con intensità simili si raggrupperanno nella stessa regione sul grafico a dispersione.
Nota: nei dati dot-plot, campioni di grandi dimensioni spesso si traducono in un cluster pesante di eventi rappresentati nella stessa regione del grafico., Esistono molti metodi per aggiungere ulteriori risoluzioni a queste regioni. Ad esempio, una mappa di calore, come nell’esempio precedente, può essere utilizzata per fornire informazioni sulla densità degli eventi in una determinata regione del grafico.
Istogrammi e dot-plots offrono entrambi diversi vantaggi per l’analisi dei dati di citometria a flusso. Scegliere il modo migliore per rappresentare i tuoi dati può aiutare a garantire che raccontino una storia completa in un formato semplice e comprensibile.
Gli istogrammi
- Sono veloci da leggere e facili da capire.
- sono più utili quando un solo parametro (ad esempio, intensità da un singolo canale fluorescente) è importante.
- La rappresentazione usuale include l’intensità di un singolo canale (asse orizzontale) rispetto al numero di eventi rilevati (asse verticale).
- È possibile utilizzare istogrammi sovrapposti multipli per confrontare un singolo parametro da due diverse popolazioni di campioni (ad es.
Dot-plots
- Sono molto utili quando è necessario confrontare i dati multiparametrici (ad esempio l’intensità dei canali side-scatter vs forward-scatter).,
- Può essere bidimensionale o tridimensionale
- L’intensità di ciascun canale è rappresentata sul proprio asse.
- Ogni evento distinto è rappresentato in un singolo punto.
- Sono una rappresentazione più complessa e più illustrativa dei dati.
I grafici a punti e gli istogrammi non si escludono a vicenda e la maggior parte degli esperimenti di citometria a flusso complessi utilizzerà più grafici per visualizzare dati ricchi e multi-parametrici su un campione.
In molti casi, è necessario tracciare più di tre parametri contemporaneamente., In questo caso, una tecnica di analisi dei dati nota come gating può aiutare a dare ulteriore risoluzione e flessibilità, consentendo l’analisi di una quantità quasi illimitata di parametri contemporaneamente attraverso diversi grafici a dispersione e istogrammi.
Gating aggiunge risoluzione ai dati di citometria a flusso
In breve, gating è un metodo per selezionare le cellule da un esperimento di citometria a flusso che si desidera analizzare in dettaglio più specifico., Gating permette a un ricercatore di raccogliere e visualizzare più informazioni su una sottopopolazione di cellule che potrebbe normalmente essere visualizzato su un 2-o 3-dimensionale dot-plot.
Gating aggiunge risoluzione a un esperimento di citometria a flusso e consente l’analisi simultanea di un numero quasi illimitato di diversi parametri (canali).
In un esperimento di citometria a flusso gated:
- Un utente raccoglie dati di citometria a flusso da uno o più canali su un grafico a punti.
- In base ai dati acquisiti, l’utente disegna una casella di gate selezionando una sottopopolazione di celle per ulteriori analisi.,
- La sottopopolazione delle celle all’interno del gate sarà evidenziata in modo specifico su altri grafici che visualizzano informazioni da canali alternativi.
Gates aggiunge un’incredibile quantità di flessibilità alla citometria a flusso, garantendo una risoluzione unicellulare per ogni canale disponibile per il ricercatore. È possibile stabilire più porte per un singolo grafico a dispersione e le porte possono essere “impilate” e combinate (cioè una sottopopolazione di celle gated per i canali 1 e 2 può essere ulteriormente gated per i canali 3 e 4 per consentire una maggiore specificità e un’analisi più approfondita).,
Un esempio di gating
Un esempio finto di gating. Nell’immagine due sottopopolazioni di celle sono gated in base ai loro profili di intensità di dispersione in avanti e laterale.
La stessa popolazione di cellule viene evidenziata da una combinazione di colori coesiva quando si analizzano due diversi canali che misurano l’intensità fluorescente nell’immagine sopra.,
Una nota sulla compensazione
Spillover da un canale in un altro può causare falsamente come segnali identificati positivi. Spillover è il segnale artefatto che un colorante fluorescente può causare nel canale di un altro fluoroforo in funzione della sua luminosità relativa e dello spettro di emissione. Questo è dove la compensazione entra in gioco. La compensazione è una procedura che isola il segnale da un particolare canale dagli altri canali utilizzati nello stesso esperimento. FITC ad esempio, ha il suo picco di emissione nella gamma verde dello spettro elettromagnetico. Tuttavia anche fluoresce nel canale giallo dove PE emette luce. In poche parole, la compensazione sottrae il segnale FITC dal canale PE.
Questo segnale nel canale “sbagliato” viene sottratto dal segnale causato dal fluoroforo di interesse. Nel campione di cui sopra, il rapporto tra il componente verde e il giallo ad una data lunghezza d’onda di eccitazione è costante per FITC., È quindi possibile dedurre la quantità di segnale FITC giallo non specifico nel canale PE dalla misurazione nel canale verde utilizzando i coefficienti di compensazione costanti. Lo stesso vale per lo spillover dal PE nel canale FITC.