Pulmonal evaluering. Lunge funksjon tester (PFT) ble utført med en Brentwood Spirometer på vårt kontor. Noen pasienter hadde gjennomgått testing andre steder.
Immun testing. Testene ble utført på Immunosciences Laboratories under ledelse av A. Wojdani, Ph. D.. I lys av viktigheten av disse testene i forbindelse med denne evalueringen, metodene som er beskrevet i detalj.,
Utarbeidelse av formaldehyd-humant serum albumin (F-HSA) og Formaldehyd-bovint serum albumin (F-BSA) konjugater:
Elektroforetiske og immunoelectrophoretic sammenligning av HSA, BSA Med F-HSA og F-BSA ble utført for å bestemme konjugasjon forekomst. Konjugasjon ble dokumentert av endret mobilitet av F-HSA, F-BSA når det ble sammenlignet med HSA eller BSA henholdsvis. Videre, antall gratis amino legge til grupper til stede i F-HSA eller F-BSA ble bestemt av metoden av Snyder og Sobocinski (1975), og ble brukt for å vurdere mengden av substitusjon., Antall amino grupper bundet til formaldehyd var 26 for HSA og 31 for BSA. I denne beregningen, dannelsen av intermolecular cross-linking ble vurdert.
Utarbeidelse av toluen diisocyanat-humant serum albumin (TDI-HSA) og Bovint serum albumin (TDI-BSA) konjugater:
Dette preparatet var tilsvarende metoder for Dewar og Baur (1982). I henhold til denne metoden, 1g HSA eller 1 g BSA ble oppløst i 100 ml av en bufferløsning som inneholder kalium klorid (på 0,05 mol/l), sodium borate (på 0,05 mol/l), PH 9.4 og nedkjølt til 4 C. Dioxane (10 ml) inneholder 0.,15 ml toluendiisocyanat ble deretter lagt dropwise mens du rører over en periode på 3 timer, etterfulgt av tillegg av 2 ml av ethanolamine, sentrifugering, dialyse filtrering og lyophilization. Tilsvarende F-HSA og F-BSA, bøyde ble bekreftet av elektroforese og fastsettelse av gratis amino grupper til stede i konjugat. Antall amino grupper bundet til å TDI var 37 for HSA og 43 for BSA. I tillegg, spectrographic analyse av kobling ble foretatt i henhold til Zeiss et. al. (1980)., Det var en markert økning i opptaket fra 230 til 260 nm som indikerte at TDI hadde blitt kovalent bundet til protein transportøren. Denne økningen i opptaket var enige med NH2-gruppen besluttsomhet bare 76% for HSA og 81% for BSA
Utarbeidelse av trimellitic anhydride-humant serum albumin (TMA-HSA) og Trimellitic anhydride bovint serum albumin (TMA-BSA):
for Å forberede disse konjugater 25 mg. av TMA ble oppløst i 0,5 ml av dioxane og lagt dropwise enten til 25 mg av HSA eller BSA oppløst i 5 ml kaldt 7% NaHCO3 i vann., Etter omrøring for 60 minutter ved 4 ° C den konjugater var dialyzed mot fire endringer på 0,1 M NaHCO3 og en endring av buffer. Til slutt konjugater ble filtrert og oppbevart ved -20 C til den skal brukes. OD analyser av TMA-HSA, og TMA-BSA ble gjort for å bestemme antall TMA rester knyttet til den tilsvarende carrier protein. Konsentrasjonen av carrier protein ble konvertert til molar konsentrasjon med molekylvekt av HSA og BSA. Fra forholdet mellom molar konsentrasjon av TMA ligand og protein carrier, forholdet mellom TMA rester per molekyler av flyselskapet ble beregnet., TMA-HSA ble anslått å inneholde 5 TMA rester per HSA molekyler og for TMA-BSA syv rester per albumin molekyl (Pien et al., 1988).
Utarbeidelse av phthalic anhydride-humant serum albumin (PA-HSA) og Phthalic anhydride bovint serum albumin (PA-BSA) konjugater:
Disse hapten-konjugater ble utarbeidet ved å legge til 75 mg PA til en avkjølt løsning på 300 mg av HSA eller BSA i 100 ml med H2O. Reaksjonsblandingen ble rørt over natten, dialyzed mot 0,1 M PBS ved hjelp av tubings med en grense på 8000 dalton. Å bruke metoden for å Zeiss et. al. (1977) den molar forholdstall ble beregnet., Den molar forholdstall ble funnet å være 22/28 for PA/HSA og 25/30 for PA/BSA.
Utarbeidelse av benzen ring HSA (B-HSA) og Benzen ring BSA (B-BSA) konjugater:
For disse forberedelsene, 40 mg. P-aminobenzoic acid ble oppløst i 2 ml 1 N HCL og kjøles ned ved nedsenkning i et isbad. En kald løsning på 14 mg/ml ble lagt dropwise. Etter hvert tillegg, blandingen ble rørt i 30 sekunder. I parallell, ett gram av HSA eller BSA ble oppløst i borsyre 0.16 M natriumklorid (0-15 M) buffer PH-9.0 (PH ble hevet med NaOH)., Kanner som inneholder løsninger for albuminer var omgitt av et isbad på magnetrører. Løsningen av diazonium salt ble lagt dropwise, med rask omrøring til den kalde protein løsning. Etter tillegg av hver dråpe PH er re-re-tunet til 9.0 9.5 med en normal NaOH. Når alle løsningen hadde blitt lagt til, reaksjonen var lov til å fortsette med sakte omrøring i minst en time med ytterligere tilføyelser av NaOH-løsningen og for å opprettholde PH på spekter av 9.0 9.5., Ureagert små molekyler ble fjernet av omfattende dialyse eller ved passering gjennom en kolonne av sephadex G-25 i kaldt rom, med en isotonisk salt-løsning som eluting buffer. OD analyser av oransje farge utvikling av B-HSA og B-BSA ble gjort for å bestemme antall B rester knyttet til den tilsvarende carrier protein. Mengden av B erstatning for HSA var ca 41 og for BSA 53 (Migrdichian, 1957).
Antistoff Bestemmelse:
Spesifikke antistoffer mot F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA og B-HSA ble analysert av et nonkompetitiv ELISA-analysen., Brønner på microtiter plater (Dynatech, Alexandria, VA) var belagt med 100 1 av antigen løsninger (100 g/ml) i 0,1 M PBS PH 7,2 over natten ved 4 C. Platene ble vasket 4 ganger med 0,1 M PBS som inneholder 0.05% tween 20 mellom hvert trinn. Gratis absorpsjon steder ble blokkert med 2% protease gratis bovine serum albumin ved romtemperatur i 4 timer og lagret ved -20 C til den skal brukes.,
Analytisk Fremgangsmåte:
prosedyren inkludert følgende: (1) vask fire ganger, (2) tillegg av 100 1 av fortynnet serum (1:2 for IgE og 1:100 for IgM-og IgG) i PBS tween-20 med 1% BSA (3) inkubasjon for 4 timer ved 20 C, etterfulgt av vask 4 ganger, (4) tillegg av 100 1 av optimal fortynning av alkalisk fosfatase merket affinitet renset geit anti-human IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) og anti-IgG (1:1000), kjøpt fra KPI (Maryland) (5) inkubasjon i 120 minutter ved 20 C, (6) å vaske 6 ganger, (7) tillegg av 100 1 av P-nitrophenyl fosfat (Sigma Chemical Co.,) (8) inkubasjon for 60 minutter ved 20 C (9) tillegg av 50 1 av 3 N natriumhydroksid løsning, og (10) dupliserte å lese. Resultatene ble beregnet basert på absorbances av dupliserte prøver av 405 nm ved hjelp av microtiter reader. Alle prøvene ble lest opp mot et HSA-antigen som en kontroll av bindende ikke spesifikke for F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA og B-HSA. Resultatene ble uttrykt som titer. Titer er å være den siste fortynning av serum som gir absorbans to ganger av HSA kontroll.,
Spesifisitet Og Cross-Hemming Studier:
For bestemmelse av antistoff-spesifisitet en cross-hemming studien ble gjennomført. Positive sera for hver hapten-protein-konjugat ble kjørt etter passende inkubasjon og nedbør med tidoblet økende trinn på hapten bundet HSA eller BSA som hemmere å dekke utvalg av antistoff mot antigen overflødig. Dette området var mellom 50 g 1000 g for hapten-BSA-og 80 g 1000 g for hapten-RSA., Etter inkubasjon ved 37 C og fjerning av bunnfall ved sentrifugering, prøvene fra før og etter cross-hemming studien ble deretter plassert på plater med brønner belagt med spesifikke konjugat. Neste skritt ble etterfulgt som beskrevet ovenfor for ELISA-studie.
IgG-og IgM-antistoff-binding til ulike konjugater ble hemmet av hapten-HSA eller hapten-BSA fra 36-85%. Ved en gitt konsentrasjon, både hapten-HSA og hapten-BSA hemmet antistoffnivå i lignende oppførsel.,
Delvis hemming av IgE-antistoff-binding til ulike hapten konjugater ble observert når serum ble pre-inkubert med hapten-HSA eller hapten-BSA. Denne ufullstendige observasjon av hemming av IgE antistoff var hovedsakelig knyttet til nonavailability av serum med høy IgE-titere mot ulike kjemikalier i vårt laboratorium.,
Fastsettelse av Normale Nivåer av Antistoffer (Kontroller):
Basert på de ovennevnte prosedyrer, 160 blod giver prøver av friske personer, av begge kjønn, mellom 22-55, ble undersøkt for antistoffer nivåer mot F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA, og B-HSA. Gjennomsnittlig titer ble 1:800 400 for IgG, 1:3200 1600 for IgM og 1:8 4 for IgE. Derfor, i vårt laboratorium titere større enn 1:1600 for IgG, 1:6400 for IgM og 1:16 for IgE er ansett som positive.,
I en gitt pasient, stiger eller faller i antistoff ved mer enn en fortynning ble vurdert som vesentlig (se tabell).
– Lymfocytt Delsett Opplisting:
En enkel laser flowcytometeret (Epos Profil: Coulter Epos, Inc., Hialeah, FL) som diskriminerer frem og høyre vinkel lysspredning, samt to farger, som ble brukt med en programvare-pakke (Quad Stat: Coulter). Mononukleære celle bestander ble bestemt av to-farge direkte immunfluorescens ved å bruke en hel blod flekker teknikk med riktig monoklonalt antistoff og flowcytometri (Fletcher et al.,, 1989) følgende par av fluorescein (FITC), eller fysoerytrin (PE)-conjugated monoklonale antistoffer (Coulter immunologi) ble valgt: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI og T11-FITC/Tal-PE for bestemmelse av T-celle – /B-cellen, T-helper/T-suppressor, NKHT3+ /NKHY3 og for alternativ sti-lymfocytt aktivering henholdsvis.
for Å overvåke lymfocytt-markører, bat kart ble satt på lymfocytt befolkningen i frem-vinkel lysspredning versus en 90 lysspredning histogram., Prosentandelen positivt fargede celler for hver markør par, så vel som prosentandelen av dobbelt fargede celler ble fastsatt. Estimater med absolutte tall av lymfocytter positivt for den aktuelle overflaten markører ble fastsatt ved å multiplisere perifere lymfocytter celle teller med den prosentandelen positivt fargede celler for hver markør par. Også andelen dobbelt fargede celler ble fastsatt., Estimater med absolutte tall av lymfocytter positivt for den aktuelle overflaten markører ble fastsatt ved å multiplisere perifere lymfocytter celle teller med den prosentandelen av positive celler for hver overflate markør.
Måling av anti-myelin grunnleggende protein-antistoffer:
Menneskelige myelin grunnleggende protein (HMBP) ble utarbeidet av metode for Diebler et al. (1972) og sjekket for renhet av polyacrylamine gel elektroforese. Antiserum å HMBP ble indusert i kaniner ved gjentatt injeksjon av HMBP i komplett Freund er adjuvans., Antistoffaktivitet i kanin sera og pasientens prøvene ble oppdaget ved å legge til ulike fortynninger (1:100 til 1:10,000) av sera for å brønner på et mikrotiterplaten tidligere belagt med HMBP som følger: HMBP 250 g/ml ble oppløst i karbonat-buffer, PH 9.6 og 200 l av denne løsningen ble lagt til hver brønn. Etter inkubering, vask og blokkerer som ovenfor, 200 1 av enten utvannet kanin eller humant serum ble lagt til brønnene. Etter inkubering for jeg time ved 37 C sera ble ristet ut av brønnene og deretter ble vasket 5 ganger med vaskemiddel., 200 1 av peroksidase-conjugated geit anti-kanin eller geit anti-human IgG, IgM eller IgA (optimal fortynning) ble lagt til den aktuelle godt. Etter inkubering og gjentatt vasking 200 1 av ABTS substrat ble lagt til hver brønn. Platene ble inkubert i én time ved romtemperatur og lese i en microtiter leser på 405 tun bølgelengde. Ved hjelp av kanin antisera; en titrering kurven ble plottet og pasientens sera ble sammenlignet med denne standard kurve., Basert på mer enn 200 kontroller og pasienter eksempel bestemmelser, liter større enn 1:2000 for IgA, 1:5000 for IgM, og 1:8000 for IgG ble vurdert som positive.