DNA-Gel Elektroforese er en teknikk som brukes for å skille og identifisere DNA-fragmenter basert på størrelse.
DNA-fragmenter av ulike størrelser er lastet inn i en porøs gel laget av agarose – et karbohydrat som finnes i røde alger.
Når et elektrisk felt er anvendt, fragmenter vil migrere gjennom gelen, takket være negativt ladet fosfatgrupper i DNA-nukleotider.
Mindre biter av DNA vil lettere vandrer gjennom gelen enn større fragmenter, som har en vanskeligere tid å bevege seg gjennom gelen matrise.,
Når gelen kjøres er fullført plasseringen av din DNA-prøver kan være i forhold til en rekke fragmenter eller bånd av kjente størrelser, kalles en DNA-stige.
nærvær av fragment av interesse kan da bli bekreftet basert på størrelsen, som fastsettes ved å sammenligne den relative plasseringen av test-prøven til fragmenter av stigen.
Agarose-gel som er forberedt på å bruke en vekt over volum % løsning. Så 1 gram av agarose i 100 ml buffer vil gjøre en 1% gel., Lavere prosent gels vil bedre løse større fragmenter og høyere prosent gels vil gjøre mindre fragmenter lettere å identifisere. For å starte gel-noe som gjør prosedyren, veier ut riktig massen av agarose i en Erlenmeyer kolbe.
Legg kjører buffer til kolben, slik at volumet av buffer ikke er større enn 1/3 av kapasiteten på kolbe. Deretter virvel å blande.
Smelte agarose/buffer blandingen ved oppvarming i mikrobølgeovn på full effekt. Hver tretti sekunder, fjern kolben og virvel innhold for å blande godt. Gjenta til agarose har helt oppløst.,
legg til Neste etidiumbromid til en konsentrasjon på 0,5 mg/ml. Etidiumbromid er en aromatisk stoff som passer i mellom individuelle base par av DNA, eller intercalates, og fører til DNA for å utløse intense oransje fluorescens under UV-lys. Det er viktig å merke seg at etidiumbromid er et kreftfremkallende stoff, så hansker bør alltid brukes ved håndtering gels inneholder denne forbindelsen.
for Å hindre gel skuffen fra fordreining, la agarose kule ved å plassere det i en 65ºC vannbad.
Som agarose er kjøling, forberede gel mugg ved å plassere gel skuffen inn i casting apparatet., Som et alternativ, kan du bruke tape for å forsegle den åpne kantene av gel skuffen for å lage formen. Å plassere en kam i gel skaper brønner hvor DNA er lastet. Kontroller at kam vil opprette en brønn som er den riktige størrelsen for DNA-prøven.
Hell smeltet agarose i gelen formen og la den stivne i romtemperatur.
Etter agarose har herdet, ta ut kammen. Hvis geleen ikke kommer til å bli brukt umiddelbart, pakk den inn i plastfolie og oppbevar ved 4 grader c før bruk.
Hvis gelen kommer til å bli brukt umiddelbart, plasserer du det i gel-boksen.,
for Å starte denne prosedyren, kan du legge til gel-loading dye til DNA-prøver å være adskilt. Loading dye er vanligvis laget på en 6X konsentrasjon. Loading dye bidrar til å visualisere og legg prøver i brønnene og bidrar til å avgjøre hvor langt prøvene har kommet under kjøring.
Angi strømforsyningen til ønsket spenning.
Nå kan du legge nok kjører buffer inn gelen i boksen for å dekke overflaten av gel. Sørg for å bruke den samme kjører buffer som brukes til å forberede gel.
Koble fører av gel-boksen til strømforsyningen og slå den på., Husk at DNA er negativt ladet, og vil bevege seg mot anoden, som er positivt, og generelt rød i fargen. Sørg for ikke å koble den sorte føre, eller katode, til bunnen av gel-boksen. Så du ikke glemmer, husk at svarte katter er uflaks, eller negative, og den svarte Katoden er derfor negativ. Kjør gelen til rødt, eller anoden. For å kontrollere at både gel-boksen, og strømforsyningen er å arbeide; utseende av bobler på elektrodene som indikerer at strømmen passerer gjennom.
Fjern lokket av gel-boksen., Sakte og forsiktig legg DNA i gelen. Igjen, loading dye i utvalget kan prøve å synke ned i gelen og vil hjelpe til å spore hvor langt utvalget har reist. En DNA-størrelse markør, eller stige, bør alltid legges sammen med den eksperimentelle prøver.
Skru på lokket. Kontroller at elektrodene er koblet til på riktig spor i strømforsyningen.
Slå på strømmen. Kjør gelen til fargen har flyttet til en passende avstand.
Når elektroforese kjøringen er ferdig, slå av strømforsyningen og fjern lokket av gel-boksen.,
Fjern gel fra gel-boksen og renne av overflødig buffer på overflaten av gel. Plasser gel skuffen, på papir håndklær til å absorbere eventuelle gjenværende kjører buffer.
for Å visualisere DNA-fragmenter, fjerne gel fra gel skuff og utsett gel til uv-lys.
DNA-fragment skulle dukke opp som fluorescerende oransje bånd. Ta et bilde av gelen.
På slutten av forsøket, riktig kast av gel og kjører buffer per institusjon forskrifter. Igjen, husk å alltid håndtere de gel og kjører buffere med hansker for å unngå etidiumbromid eksponering.,
Nå som du har sett hvordan å utføre DNA-gel elektroforese. La oss ta en titt på noen nedstrøms programmer og varianter av dette svært nyttig metode.
Her kan du se en agarosegel-elektroforese resultat etter separering av PCR-produkter. DNA-fragmenter som er lagt inn i gel er synlig som klart definert band. DNA-standard eller stige bør skilles ut i en grad som gjør det nyttig fastsettelse av størrelser av eksempler på band. I dette eksemplet, DNA-fragmenter av 765 base-par, 880 base-par og 1022 base-par er skilt ut på en 1.,5% agarosegel med en 2-log DNA-stigen.
I tillegg til å bekrefte tilstedeværelsen av et DNA-fragment som er av interesse, DNA-gel elektroforese kan kombineres med gel rensing prosedyrer. Vanligvis barberkniv brukes til å kutte ut DNA-fragment av interesse, slik at det kan bli samlet inn og DNA-prøven innen det utvinnes.,
agarosegel electrophesis kan også kombineres med overføring blotting, som innebærer slik at DNA eller RNA, for overføring til en cellulose membran hvor radioaktive prober kan brukes til å identifisere spesifikke DNA-eller RNA-sekvenser i electrophoretically-skilt eksempel.
Standard DNA-gel elektroforese er ikke ideelt for separasjon av høy molekylvekt DNA større enn 15-20 kb i størrelse, som genomisk DNA. For å skille store DNA-prøver, puls felt gel elektroforese er brukt, som innebærer å utsette en gel for å få en endring, eller blinker, elektrisk felt i forskjellige retninger., Denne teknikken innebærer en spesialisert gel kjører apparatet, som har par av elektroder plassert i forskjellige retninger rundt gel. Dette kan brukes til å oppdage forskjeller i genom-størrelser mellom populasjoner av organismer, som den sammenslåtte DNA-prøver fra ulike mikrobielle samfunn, som du ser her, som er hentet fra ulike lake miljøer.
Du har bare sett en introduksjon til DNA-gel elektroforese., Vi viste deg konseptet bak metoden, hvordan å forberede agarosegel, hvordan legge inn dine prøver, hvordan å kjøre gel, og analysere det og noen vanlige bruksområder for agarose gel elektroforese. Takk for å se på og lykke til med å kjøre gel.