Hva er flowcytometri (FACS-Analyse)?

som Opprinnelig ble utviklet på slutten av 1960-tallet, flowcytometri er et populært analytisk celle-biologi teknikk som bruker lys for å telle og profil celler i en uensartet flytende blanding. Flowcytometri er en spesielt kraftig metode fordi det gjør det mulig for en forsker å raskt, nøyaktig, er det enkelt å samle inn data knyttet til mange parametere fra en heterogen væske blanding som inneholder levende celler.,

flowcytometri er mye brukt gjennom hele livet og biomedisin, og kan brukes i enhver situasjon hvor en forsker har behov for å raskt profil en stor bestand av løse celler i et flytende medium. For eksempel, i immunologi flowcytometri er brukt til å identifisere, skille, og karakteriserer ulike immunceller undertyper kraft av sin størrelse og morfologi.

Dersom ytterligere informasjon er nødvendig, antistoffer merket med fluorescerende fargestoffer, og reist mot svært spesifikke celleoverflaten antigener (f.eks., klynger av differensiering eller CD-markører) kan brukes til å bedre identifisere og skille bestemt sub-populasjoner innen en større gruppe.

I flowcytometeret

• Eksempel celler er gikk gjennom en smal kanal, én om gangen.
• Lys brukes til å belyse celler i kanalen.
• En serie av sensorene registrerer typer lys som brytes eller slippes ut fra cellene.
• Data ervervet av sensorene som er samlet og integrert for å bygge et helhetlig bilde av prøven.,

FACS-Antistoffer i dag brukes til Forskning

Forskjellige Typer Lys som brukes i en flowcytometri Eksperiment

En flowcytometeret bruker brytes eller slippes ut lys for å telle og identifisere celler. Lære om ulike typer av lys som brukes i en flowcytometri eksperiment i følgende figurer.,

Forward Scatter

Videresend spredt lys brytes av en celle i flyten kanal og fortsetter i lett bane (dvs. samme retning som lyset ble opprinnelig reiser). Frem lyset er oppdaget av en sensor i lys banen, og er vanligvis brukes til å identifisere partikkel størrelse.

Videresend lyset er mest brukt for å avdekke størrelsen på objektet i lys banen., Større gjenstander vil produsere mer frem spredt lys enn mindre objekter, og større celler vil ha en sterkere frem scatter-signal

Side Scatter

Siden spredt lys lys går fra belysning kilde til flow-kanal, er brytes av celler i en retning som er utenfor det opprinnelige lyset banen. Side-lyset er oppdaget av en sensor som er ortogonale til den opprinnelige lett bane.,

Side-lyset er vanligvis brukt til å gjøre en beslutning om detaljer og kompleksitet av cellen i lys banen. Svært detaljert celler med en stor mengde intern kompleksitet, som neutrofiler, vil produsere mer side-spredt lys, og en høyere side-scatter-signal enn celler med en lav-detaljer og kompleksitet.

Fluorescens Utslipp

Fluorescerende lys som slippes ut av fluorescerende molekyler etter eksitasjon av en kompatibel bølgelengde laser., Fluorescerende lys kan stamme fra naturlig fluorescing materialer i cellen, eller de kan stamme fra fluorescerende fargestoffer eller fluorescens-merkede antistoffer som har blitt brukt til å merke en bestemt struktur på cellen.

Multiparametric Analyse

En mock flowcytometri dot-tomten, plotting frem vs side-spredt fra en bestand av leukocytter., Celle bestander er preget av deres sannsynlig identitet:

D Antatt rusk, veldig små elementer med lav fremover – og side – og scatter.

L/M Sannsynlig leukocytter/monocytter, små til middels store celler med lav intern kompleksitet/detaljer. Disse cellene generere en middels frem-scatter og lav side-scatter-signal intensitet

G Sannsynlig granulocytter, store celler med høy intern kompleksitet/detaljer. Disse cellene generere høy fremover – og side-scatter-signaler.,

Mens noen identiteter kan være bekreftet av fremover og fra side scatter-profiler, merking med en celle-type bestemt markør alltid gir større oppløsning og sikkerhet når profilering komplekse heterogene populasjoner av celler.

For eksempel, i handlingen ovenfor, en forsker kan være i stand til å skille mellom granulocytter og lymfocytter ved å bruke fremover, og siden spredt lys. Men tre klasser av granulocytter (neutrofiler, basophils, og eosinofile) er svært like i størrelse og struktur, noe som gir dem ligner lys-spredning egenskaper., I dette tilfellet, neutrofiler kan være selektivt merket kraft av sin ytringsfrihet en nøytrofile bestemt markør som ELANE.

FACS: Sortering Celler basert på flowcytometri Data

vilkår flowcytometri og fluorescens-aktivert celle-sortering (FACS) brukes ofte om hverandre. I praksis er det forskjeller mellom de to metodene.

FACS er et derivat av flowcytometri som gir en eksepsjonell grad av funksjonalitet. Ved hjelp av FACS en forsker kan fysisk form en heterogen blanding av celler i ulike populasjoner.,

Ved hjelp av svært spesifikke antistoffer merket med fluorescerende fargestoffer, en forsker kan utføre FACS analyse og samtidig samle inn data på, og sorterer en prøve av et nesten ubegrenset antall av forskjellige parametre.

I en FACS Eksperiment:

• Videresend-scatter -, side-scatter, og fluorescerende data er samlet inn, som i konvensjonelle flowcytometri.
• brukerdefinerte parametere gi informasjon om hvordan cellene skal være sortert.
• Basert på disse parametrene, den FACS-maskinen bruker en elektrode til å pålegge en elektrisk ladning på hver celle.,
• Ved avslutning flyten kammer, electromagnets vil sortere celler ved lade i egne fartøy.

Hva gjør flowcytometri Data ser ut som?

I en flowcytometri eksperiment, hver celle som passerer gjennom flowcytometeret og er registrert vil bli klassifisert som en avgrenset hendelse.

i Tillegg, hver type lys som er oppdaget av flowcytometeret (fremover-scatter -, side-scatter, og hver bølgelengde av fluorescens-utslipp), vil bli tildelt sin egen unike kanal., Flowcytometri data tomten hver hendelse uavhengig av hverandre, og vil representere signalet i intensiteten av lyset oppdaget i hver kanal for hver hendelse.

flowcytometri data er vanligvis representert på én av to måter: histogrammer, som måle eller sammenligne kun en enkelt parameter, og dot-plott som sammenligner 2 eller 3 parametre samtidig på en to – eller tre-dimensjonale scatter-plot.

Et histogram vanligvis tomter intensiteten oppdaget i en enkelt kanal langs den ene aksen og antall hendelser som er oppdaget på at intensiteten er i en egen akse., Et stort antall hendelser som er oppdaget på en bestemt intensitet vil bli vist som en pigg på histogrammet.

i motsetning, i et prikkplott, hver hendelse er representert som et enkelt punkt på en scatter-plot. Intensiteten av 2 forskjellige kanaler (eller 3 ulike kanaler i en tre-dimensnal tomt) er representert langs ulike akser. Hendelser med tilsvarende intensitet vil klynger seg sammen i den samme regionen på scatter-plot.

Histogrammer og dot-plott både gir ulike fordeler for flowcytometri data-analyse. Velge hvordan du best til å representere dine data kan bidra til å sikre at den forteller en sammenhengende historie på en enkel, forståelig format.

Dot-plott og histogrammer er ikke gjensidig utelukkende, og mest komplekse flowcytometri eksperimenter vil gjøre bruk av flere tomter for å vise rik, multi-parametrisk data på en prøve.

I mange tilfeller mer enn tre parametere må plottes samtidig., I dette tilfellet, en data-analyse teknikk kjent som avgrensning kan bidra til å gi ekstra oppløsning og fleksibilitet, med mulighet for en analyse av en nesten ubegrenset mengde parametere samtidig i flere forskjellige scatter-plott og histogrammer.

Avgrensning legger Oppløsning til flowcytometri Data

kort sagt, avgrensning er en metode for å velge celler fra en flowcytometri eksperiment som du vil analysere i mer spesifikke detaljer., Avgrensning gjør at en forsker for å samle og vise mer informasjon om en subpopulasjoner av celler enn normalt kunne vises på en 2 – eller 3-dimensjonale dot-tomten.

Avgrensning legger oppløsning til en flowcytometri eksperiment, og gir mulighet for simultan analyse av et nesten ubegrenset antall forskjellige parametre (tv).

I en gated flowcytometri Eksperiment:

• En bruker samler flowcytometri data fra én eller flere kanaler på en prikk-tomten.
• Basert på dataene som er kjøpt, brukeren trekker en gate boksen for å velge en subpopulasjoner av celler for videre analyse.,
• subpopulasjoner av celler innenfor porten vil være spesielt markert på andre tomter vise informasjon fra andre kanaler.

Gates legge til en utrolig mengde av fleksibilitet til flowcytometri, gi opp til én celle oppløsning for hver kanal tilgjengelig for forskeren. Flere porter kan bli etablert for en enkelt scatter-plot, og gates kan være «stablet» og kombinert (dvs. subpopulasjoner av celler gated for i kanal 1 og 2 kan bli ytterligere gated for tv 3 og 4 for å tillate mer spesifisitet og dypere analyse).,

Et eksempel på avgrensning

En merknad på Kompensasjon

«Spillover» fra én kanal til en annen kan føre til feilaktig som positivt identifisert signaler. Dette er artefactual signal om at en fluorescerende fargestoff kan føre til en kanal til en annen separeres fluoroforen som en funksjon av dens relative lysstyrke og utslipp spekter. Dette er hvor kompensasjonen kommer inn i bildet. Erstatning er en prosedyre som isolerer signalet fra en bestemt kanal fra de andre kanalene som brukes i det samme eksperimentet. FITC f.eks., har sine utslipp toppen i den grønne delen av det elektromagnetiske spekteret. Det gjør imidlertid også fluoresce i den gule kanalen der PE avgir lys. Enkelt sagt, kompensasjon trekker FITC signal fra PE-kanal.

Dette signalet i «feil» channel er trukket fra signal forårsaket av fluoroforen av interesse. I ovennevnte eksempel, forholdet mellom den grønne og den gule komponent på et gitt eksitasjon bølgelengden er konstant for FITC., Det er dermed mulig å utlede mengden av uspesifikke gule FITC-signal i PE-kanal fra målingen i den grønne kanalen ved hjelp av konstant kompensasjon koeffisienter. Det samme gjelder for «spillover» fra PE inn FITC-kanal.