SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektroforese) er ofte brukt i laboratoriet for separasjon av proteiner basert på deres molekylvekt. Det er en av de teknikkene som brukes ofte, men ikke ofte fullt ut forstått. Så la oss prøve og fikse det.
SDS-PAGE skiller proteiner i henhold til deres molekylvekt, basert på deres differensial priser til migrasjon gjennom en sikting matrix (gel) under påvirkning av en brukt elektrisk felt.,
Gjør Frekvensen av Protein Migrasjon Proporsjonal med molekylvekt
bevegelse av noen belastet arter gjennom et elektrisk felt er bestemt av dets netto kostnad, den molekylære radius og omfanget av de påførte feltet. Men problemet med innebygd kastet proteiner er at ingen netto kostnad eller deres molekylære radius er molekylvekt avhengige. I stedet, netto kostnad bestemmes av aminosyre-sammensetning, dvs. summen av de positive og negative aminosyrer i proteinet og molekylær radius av protein er tertiær struktur.,
Så i sin opprinnelige tilstand, ulike proteiner med samme molekylvekt ville migrere ved forskjellige hastigheter i et elektrisk felt, avhengig av kostnad og 3D-form.
for Å skille proteiner i et elektrisk felt, basert på deres molekylvekt bare, vi trenger å ødelegge de tertiær struktur ved å redusere protein til et lineært molekyl, og det er noe mask den reelle netto kostnad av protein. Det er der SDS kommer inn.,
Rollen som HMS-datablad (et al)
SDS er et vaskemiddel som er til stede i SDS-PAGE eksempel buffer der, sammen med litt kokende, og et reduksjonsmiddel (normalt DTT-eller B-MEG for å bryte ned protein-protein disulphide obligasjoner), det forstyrrer tertiær struktur av proteiner. Dette bringer kastet proteiner ned til lineær molekyler.
SDS også strøk protein med en ensartet negativ ladning, som skjuler de reelle kostnader på R-grupper. SDS binder seg ganske jevnt til den lineære proteiner (rundt 1.,4g SDS/ 1g protein), noe som betyr at ansvaret for protein er nå omtrent proporsjonal til sin molekylvekt.
SDS er også til stede i en gel for å sørge for at når proteiner er linearized og deres kostnader maskert, de fortsette slik gjennom hele oppkjøringen.
Den dominerende faktoren i å bestemme en SDS-belagt protein er at det er molekylær radius., SDS-belagt proteiner har vist seg å være lineær molekyler, 18 Angstroms bredt og med en lengde som er proporsjonal med deres molekylvekt, så den molekylære radius (og dermed deres mobilitet i gel) er bestemt av den molekylære vekten av protein. Siden SDS-belagt proteiner har samme kostnad til masse forholdet, vil det ikke være noen forskjellsbehandling migrasjon basert på lade.
Gel Matrix
I en anvendt, elektrisk felt, SDS-behandlet proteiner vil nå bevege seg mot den positive anode på ulike priser avhengig av deres molekylvekt., Disse ulike mobilities vil være overdrevet på grunn av høy friksjon miljø av en gel matrise.
Som navnet antyder, gel matrise som brukes for SDS-PAGE er polyakrylamid, som er et godt valg fordi det er kjemisk inert og, det som er avgjørende, kan enkelt gjøres opp på et utvalg konsentrasjoner for å produsere ulike pore størrelser gir en rekke skille forhold som kan endres, avhengig av dine behov. Du husker kanskje at jeg tidligere skrev en artikkel om mekanismen av akrylamid polymerisering.,
Usammenhengende Buffer-Systemet og Legger dem i bunker Gel – Fôr Dem Opp på startstreken
til Å gjennomføre gjeldende fra katoden (negative) til anoden (positiv) gjennom gel, en buffer er åpenbart nødvendig. For det meste bruker vi usammenhengende Laemmli buffer system. «Usammenhengende» betyr bare at bufferen i gel, og tanken er forskjellige.
Vanligvis, systemet er satt opp med å stable gel ved pH 6.8, beskyttet av Tris-HCl, en kjører gel-bufret til pH 8.8 av Tris-HCl og en elektrode buffer ved pH 8.3., Stakking gel har en lav konsentrasjon av akrylamid og kjører gel en høyere konsentrasjon i stand til å bremse bevegelsen av proteiner.
Så hva er det med alle de forskjellige pH er?
Vel, glysin kan finnes i tre forskjellige lade stater, positiv, nøytral eller negativ, avhengig av pH. Dette er vist i diagrammet nedenfor. Kontroll av avgiften state of the glysin av ulike buffere er nøkkelen til hele stabling gel ting.,
Slik at her er hvordan du legger dem i bunker gel fungerer. Når strømmen er slått på, negativt ladet glysin ioner i pH 8.3 elektrode buffer er tvunget til å angi stabling gel, hvor pH 6.8. I dette miljøet, glysin skifter hovedsakelig til zwitterionic (nøytralt ladet) tilstand. Dette tapet av avgift får dem til å bevege seg veldig sakte i det elektriske feltet.
Cl – – ioner (fra Tris-HCl) på den annen side, bevege seg mye raskere i det elektriske feltet, og de danner en ion foran som migrerer i forkant av glysin., Separasjon av Cl – fra Tris counter-ion (som nå går mot anoden) skaper en smal sone med en bratt spenning gradient som trekker glysin sammen bak det, noe som resulterer i to snevert atskilt fronter med å migrere ioner; de svært mobile Cl – fronten, etterfulgt av den langsommere, for det meste nøytral glysin foran.,
Alle av proteiner i gel eksempel har en elektroforetiske mobilitet som er mellomledd mellom den ekstreme av mobilitet av glysin og Cl-, så når de to fronter feie gjennom prøven vel, proteiner er konsentrert i smal sone mellom Cl – og glysin fronter.
Og De er igang!
Dette prosesjon bærer på til den treffer kjører gel, hvor pH skifter til 8.8. Ved denne pH den glysin-molekylene er for det meste negativt ladet og kan overføre mye raskere enn proteiner., Så glysin foran akselererer forbi proteiner, og etterlot dem i støvet.
resultatet er at proteiner er dumpet i et veldig smalt band på grensesnittet til stabling og kjører gels og siden den kjører gel har en økt akrylamid konsentrasjon, som bremser bevegelsen av proteiner i henhold til deres størrelse, separasjon begynner.
Hva Var Alle av den Om?
Hvis du fortsatt lurer på hvorfor du legger dem i bunker gel er nødvendig, tenk på hva som ville skje hvis du ikke bruker ett.,
Gel brønner er rundt 1 cm dypt, og du vanligvis trenger for å kunne fylle dem for å få nok protein på gel. Så i mangel av en stabling gel, ditt eksempel ville sitte på toppen av den kjører gel, som et band av opp til 1 cm dyp.
Snarere enn å være stilt opp sammen og treffer kjører gel sammen, ville dette bety at proteiner i ditt eksempel ville alle inn den kjører gel på forskjellige tider, noe som resulterer i svært utflytende band.,
Så legger dem i bunker gel sikrer at alle proteiner kommer til å kjøre gel på samme tid slik at proteiner av samme molekylvekt vil migrere så tight band.
Separasjon
Når proteiner er i gang gel, de er atskilt fordi høyere molekylvekt proteiner bevege seg saktere gjennom de porøse akrylamid gel enn lavere molekylvekt proteiner. Størrelsen på porene i gelen kan bli endret avhengig av størrelsen på proteiner du ønsker å separere ved å endre akrylamid konsentrasjon. Typiske verdier er vist nedenfor.,
For en bredere separasjon rekkevidde, eller for proteiner som er vanskelig å skille, en gradient gel, som har lag med økende akrylamid konsentrasjon, kan brukes.