Spesifisitet og Effektivitet av Uracil DNA Glycosylase-Mediert Strand Spalting Kartlagt på Store Sekvens Biblioteker

UDG-mediert uracil eksisjon og kjemiske AP nettstedet spalting på microarrays

DNA-strand spalting mediert av UDG består av to separate trinn: eksisjon av uracil base etterfulgt av spalting av den resulterende abasic nettstedet. De to trinnene kan være separat overvåket på DNA microarrays., Første, abasic nettsteder er generert ved behandling av tabellen med UDG og i det andre trinnet, strand spalting er indusert ved å utsette bakke-bundet, DNA-oligonukleotider som inneholder abasic steder å enten sure eller grunnleggende betingelser, eller ved å fordampe overflaten er tørr. Slike kjemiske strategier for å holde seg abasic områder på DNA-tråder eliminere behovet for ytterligere enzymatisk spalting og mulighet for UDG kinetikk som skal studeres uavhengig av hverandre., For dette formål, matriser av 30mer DNA-sekvenser med et økende antall ikke-påfølgende dU-incorporations (dU1 – dU9) ble designet og fremstilt av maskless nukleinsyre photolithography, ved hjelp av tilsvarende lysfølsomme dU phosphoramidite (Fig. 2). Hver DNA-strand ble syntetisert med en dT15-linker til glasset og avsluttet ved 5′-enden med en 25mer målsekvens for hybridisering (QC25), som vist i Fig. 3.,

plasseringen av alle probe sekvenser sammen med tilsvarende replikater og kontroll tråder bærer dT i stedet for dU nukleotider ble randomisert over microarray overflaten., Før enzymatisk prosessering, DNA-probe-sekvenser ble hybridiserte til Cy3-merket utfyllende 25mer oligonukleotid (QC25c) for å bestemme innledende fluorescens intensitet verdier. 3′-Cy3 merking ble brukt for å forhindre mulig fluorescens gjenstander på grunn av interaksjoner av fargestoff med et variabelt antall dUs46. Den microarrays ble deretter utsatt for kommersielt hentet UDG fra E. coli og abasic nettstedet spalting ble senere utført under ulike forhold. Den optimale enzym eksponeringstid ble bestemt i første forsøk. Våre resultater (Fig., S1) viser at etter tillegg av enzymet, cleavage effektivitet øker betydelig med tid, opptil en time, nå en effektivitet på rundt 50-60%, med bare noen små endringer på ytterligere eksponering til UDG. Dermed har vi satt optimal eksponering tid til en time. I tillegg til våre data viser tydelig økt spalting effektivitet med et økende antall av dU, fra 40 til 60% (Fig. 3C og S1).

Vi flyttet deretter videre til å studere den faktiske spalting trinn, fjerning av abasic nettstedet etter eksisjon av uracil base., Følgende kjente strategier for kjemisk indusert abasic nettstedet spalting i solution20,30, noe som resulterer AP-nettsteder så ble spaltet enten under alkaliske betingelser ved å dyppe den matriser i et 1:1 (v/v) løsning av etylendiamin(EDA)/etanol, eller matriser ble behandlet under sure forhold ved å dyppe i en 30% (v/v) løsning av trekloredikksyre i dichloromethane, eller ved fordamper på overflaten av tabellen til tørrhet. I alle metoder, behandlinger ble utført for ulike tidsperioder, alt fra 1 til 24 timer., Deretter systemene ble rehybridized til Cy3-merket utfyllende 25mer oligonukleotid (QC25c) og den resulterende fluorescens intensitet ble sammenlignet med de som ble oppnådd før UDG behandling for å finne ut spalting effektivitet. Den resulterende spalting priser er angitt i Fig. 4.

Under grunnleggende forhold (Fig. 4B), at spalting av AP nettsteder krever et minimum incubation periode på 2 timer for å observere betydelige spalting (40 til 60%) av underlag. Imidlertid, behandling av matrisen med en syre eller tørking av overflaten (Fig., 4A,C, henholdsvis) resultater i klare og omfattende spalting etter bare en time (30 til nesten 80%, med en syrlig behandling), når EDA-mediert abasic nettstedet spalting er minimal etter en time. Det er sannsynlig at spalting selve reaksjonen i A-og C-metoder er fremmet ved den endelige hybridisering scenen, enten på grunn av temperaturen eller tilstedeværelse av en amine i bufferen., Likevel, siden hybridisering er felles for alle tre metodene, er det store forskjeller i cleavage kinetikk mellom grunnleggende og ikke-grunnleggende behandlinger hint på muligheten for at flere AP-områdene kan være produsert i nærvær av en syre, eller under redusert trykk, noe som gir flere posisjoner på DNA-tråder som en følge spalting reaksjon kan oppstå. Lenger behandlinger, uavhengig av metode, ikke vesentlig endrer omfanget av cleavage, vanligvis nærmer seg 40% til 80%, avhengig av antall dU incorporations., Faktisk, ser vi en klar økning i cleavage effektivitet med et økende antall av dU-incorporations, under alle testede forhold.

I tillegg til å utføre kjemisk indusert DNA-strand spalting på abasic nettstedet steder, den kvaliteten på microarray overflaten ble undersøkt. For dette formål, ensartethet av funksjonene på tabellen overflater visuelt inspisert basert på fluorescens intensitet og tap av fluorescens for ikke-cleavable kontroll tråder som ble overvåket., Vi fant at abasic nettstedet spalting under alkaliske forhold som er tillatt for bestemte enzym mediert spalting av dU-som inneholder sekvenser, men forlot kontroll sekvenser nesten urørt, mens under sure forhold, DNA-strand spalting ble også observert for kontroll tråder mangler uracil nukleotider (Fig. S2). Tørke overflaten førte også til nedbrytning av dT-bare kontroll tråder. Siden bare abasic nettstedet spalting under alkaliske forhold unngår overflate fornedrelse og ikke-spesifikke tap av DNA, har vi utført alle etterfølgende eksperimenter under disse forholdene., Dette sikrer at ikke-cleavable kontroll sekvenser er fortsatt tilgjengelig for sammenligningen, selv etter lang kjemisk behandling.

Enkel – og dobbel-strandet UDG sekvensiell avhengighet

Siden våre resultater på E. coli UDG-mediert dU cleavage, bare levert moderat spalting effektivitet for DNA-tråder som inneholder eneste dU incorporations (≈40%), vi har avhørt sekvensen spesifisitet av UDG for å identifisere potensielt en svært spaltet dU-som inneholder underlaget. For dette formålet, har vi utformet en dU-som inneholder nukleinsyrer bibliotek fra dobbelt – og enkeltrom-strandet DNA-sekvenser., Biblioteket består av et 7mer permutable sekvens med et enkelt dU i midten (Fig. 5). Permutasjon av 3-nt flankerer regioner, 5′- så vel som 3′ av dU resultater i 4096 unike sekvenser. I dobbel-strandet format, en sløyfe og utfyllende rekkefølge til 7mer ble lagt til, som fører til dannelsen av en hårnål struktur. Ekstra dG·dC-base-par i skarpe stammen bidratt til å øke smeltetemperaturen av skarpe DNA-strukturen. Disse base-par ble lagt til enkelt-fast underlag for å holde ssDNA og dsDNA design så likt som mulig., Til slutt, en 25mer oligonukleotid ble lagt inn i 5′-enden av hver design for å tjene som en krysning mål. En representant figur av sekvensen design er vist i Fig. 5.

Selv om terminal-merking av DNA med et fluorescerende fargestoff er en praktisk metode for å direkte måle fluorescens intensitet, det bærer ulempen med høy fluorescens støy som, spesielt på høy tetthet microarrays, gjør data utvinning og tolkning mer vanskelig. Derfor bestemte vi oss for å overvåke spalting reaksjon via hybridisering til det immobiliserte sekvenser., Før behandling med UDG, enkel – og dobbel-strandet DNA underlag var hybridiserte til merket utfyllende 25mer oligonukleotid og skannes for å få første fluorescens verdier. Deretter, microarrays ble utsatt for UDG for ulike tidsperioder. Etter følgende AP-området spalting under alkaliske forhold, matriser ble igjen hybridiserte til sine Cy3-merket utfyller. Reduksjon av fluorescens signal av DNA-tråder i forhold til pre-behandling fluorescens verdier tilsvarer direkte til spalting effektivitet., Maksimal spalting effektivitet på rundt 40% ble oppnådd for dobbel-strandet underlag etter UDG inkubasjon i 2 minutter, og litt lavere spalting priser for enkelt-fast underlag (Tabell S1). Denne lavere pris for enkelt-strandet motsier tidligere studier som indikerer at de er spaltet raskere enn deres dobbel-strandet equivalents13,47,48. Interessant, veldig kort enzym inkubasjoner (<1 min) fortsatt føre til betydelige spalting effektivitet (30-35%)., Disse kort tid poeng er spesielt interessant siden de gir klare hint av potensielle sekvens preferanser. For å identifisere sekvensiell avhengighet i UDG-mediert degradering av DNA fra vårt sett av 4096 individuelle tråder, vi fokusert på 1% (Fig. 6) samt 5% (Fig. S3) av de mest og minst spaltet delsett av sekvenser. Representant sekvens motiver som genereres fra de sekvens undergrupper er vist i Fig. 6 og i Supplerende Opplysninger.,

For dobbel-strandet DNA (Fig. 6A,B), viser resultatene en klar UDG sekvens preferanse for G/C-rike områder som flankerer uracil. I motsatt fall, UDG virker for dårlig prosess dobbel-strandet underlag som inneholder T·En base par. Motivene er hentet ut fra bedre og dårligere UDG underlag er delvis i samsvar med svært begrenset eksisterende litteratur data48,49,50. Seibert et al., en hypotese om at effektiviteten av E. coli UDG er knyttet til den energetiske kostnadene for DNA-bøying og forvrengning som oppstår i prosessen med spesifikke skader anerkjennelse. I molekylær dynamikk simuleringer og tid-løst fluorescens eksperimenter med to uracil-inneholder dobbel-strandet DNA-sekvenser, de som er identifisert som den effektive bøying kraft konstanter er lavere hvis dAs-eller dTs-er som ligger i tilknytning til uracil nukleotid, i stedet for dGs og dCs; noe som tyder på at dA/dT-rik sekvenser kan være mer lett bøyd av UDG og dermed bedre processed49., Siden single-strandet DNA er en mye mer fleksibel form av DNA, sin raskere behandling som er rapportert i litteraturen kan være på grunn av lavere energetiske kostnadene for spalte underlag som er dypest sett er mer fleksibel enn dsDNA7,47,49,51. Bøying kan imidlertid ikke være en avgjørende faktor i UDG spalting spesifisitet av ssDNA, med enzymet gjenkjenne og spalte alle underlag like godt, noe som kanskje forklarer fraværet av sekvensen konsensus i dU-som inneholder ssDNA., Det var likevel en hypotese om at sekvensen sammenheng virkninger fortsatt utvide til enkelt-strandet DNA, og faktisk hadde blitt observert for UDG fra herpes simplex virus type 152, men fortsatt er uklar for menneskelig eller E. coli UDG. Slupphaug et al. målt sekvensen spesifisitet av Menneskelig UDG i 34 dsDNA sekvens sammenhenger og mente at dT 3′ til dU alltid resulterer i sakte fjerning som gjorde, noe discordantly, en høy GC content50. Eftedal et al. vurdert spalting effektivitet for både kalv thymus og E. coli UDG fra 41 dsDNA sekvenser og fant et lignende mønster., Med våre vesentlig større sett av sekvenser, kan vi enige om at dT 3′ til dU alltid resulterer i sakte fjerning, men våre data viser tydelig at dC, og dG til en viss grad, 3′ til dU resulterer i rask fjerning. Vi var ikke i stand til å identifisere betydelige sekvensiell avhengighet for dU eksisjon på ssDNA (Fig. 6C,D). Det bør bemerkes at sekvensiell avhengighet i dsDNA underlag er klart for kort enzymatisk behandlinger (5s, 30, 60-tallet, og 120s), men sakte svinner for lengre UDG eksponering (30min), noe som indikerer at alle underlag er slutt spaltet når de utsettes for enzymet.,

Spalting nettstedet optimaliseringer

Siden ingen vesentlige sekvensiell avhengighet for UDG-mediert uracil eksisjon på enkelt-strandet DNA dukket opp fra våre studier og heller moderat spalting effektivitet for enkelt-dU incorporations ble innhentet, valgte vi å studere UDG-mediert dU eksisjon på lengre enkelt-fast underlag som inneholder ulike former for flere dU incorporations, som sikter mot å identifisere spesifikke spalting områder som er lett enzymatically tilgjengelig og mulighet for rask og effektiv strand cleavage., Vår begrunnelse er at økt avstand av sonden fra overflaten bør gi større tilgjengelighet for spalting, men denne effekten kan ikke bære over til en lang avstandsstykker (>20-nt)53. Basert på resultatene fra Fig. 3, vi også forvente et høyere antall dU incorporations å føre til økt samlet cleavage, men vi lurer på om det er en optimal tetthet av dU nukleotider i cleavable delen av DNA-strand. Derfor undersøkte vi uracil spalting på lengre dU homopolymers (10, 15 og 20mers) så vel som på oligomers med varierende %dU sammensetning., Prosentandelen av dU i oligomer ble beregnet i forhold til de andre fire nukleotider (dA, dC, dG og dT) og eksperimentelt oppnådd ved å utføre kopling reaksjoner med pre-blandet løsninger av dU/dA/dC/dG/dT phosphoramidites i ulike forholdstall (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 eller 100:0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). Sekvensene, bygget på poly-dT linkers av varierende lengder (dT1, dT5, dT10 og dT15), og dU-som inneholder regionen ble deretter avsluttet med en 25mer målsekvens for hybridisering formål som er angitt i Fig. 7.,

Etter syntese, den 25mer var hybridiserte til sin komplementære 5′-Cy3 merket oligonukleotid og microarray ble utsatt for UDG for 1 time., Da spalting av abasic området ble utført under alkaliske forhold, etterfulgt av en siste rehybridization. I parallell, vi har også utført cleavage analysen med BRUKEREN enzym, som i dette tilfellet eliminerer behovet for en ekstra abasic nettstedet spalting prosedyre.

For enzymet analysen med UDG etterfulgt av abasic nettstedet spalting under alkaliske forhold (Fig. 7, venstre), registrerte vi spalting effektivitet alt fra 4% til 80%, og med klare trender dukker opp., For eksempel, cleavage effektivitet øker betydelig med økende lengde av dU-som inneholder regionen, i den rekkefølgen 10mer > 15mer > 20mer, med et maksimum på ~50% spalting tilgjengelig for en 10mer dU-regionen, og maksimalt 80% for 20mer dU-regionen. På samme måte lenger linkers resulterer i en samlet høyere spalting pris. Disse observasjonene tyder på at lengre sekvenser er bedre anerkjent og tilsvarende uracil baser bedre excised av UDG, noe som igjen tyder på en større tilgjengelighet av lengre underlag av enzymet., Cleavage effektivitet er også påvirket av mengden dU nukleotider i cleavable del av substratet. Faktisk, uracil homopolymers (100% – gare), er nesten alltid mindre spaltet enn sine congeners med ispedd dU nukleotider, og denne effekten er særlig tydelig når underlag er syntetisert i løpet av en kort T1 linker. På den annen side, øker dU innhold fra 12 til 50% er møtt med økende spalting effektivitet, med 50% dU synes å være den optimale mengden., Dermed under våre eksperimentelle betingelser, UDG-mediert spalting var den mest effektive på lengste underlag der halvparten av nukleotider i cleavable del, er dU (80% spalting effektivitet). Denne trenden, samt data som er vist i Fig. 3, tyder på at UDG kan gjenkjenne og binde seg til flere dU incorporations, så lenge dUs er atskilt med kanonisk DNA-nukleotider.

Mens kort homopolymers er generelt kjent for å være dårlig UDG underlag, vi forventet også å observere lav utringning priser for 20mer cleavable regioner siden slike underlag er lite sannsynlig å bli funnet i DNA., In vivo, uracil baser i hovedsak skje i DNA-tråder på grunn av misincorporation under replikasjon eller på grunn av deamination8,9 og begge prosessene er neppe skje på en så høy frekvens for å danne homopolymers. Likevel, moderat til høy spalting effektivitet på rundt 60% på lang 20mer dU homopolymers ble innhentet, men om de homopolymers er behandlet tregere enn underlag med lavere %dU innholdet gjenstår å bli undersøkt.

Behandling av en lignende DNA-array bibliotek med BRUKEREN enzym system (Fig., 7, fra høyre) fører til en tilfredsstillende spalting av enkelt-fast underlag, med spalting trender noe tilsvarende til UDG tilfellet, men med noen viktige unntak. Første, den høyeste spalting effektiviteten er lavere enn for UDG/EDA system (55% mot 80%, henholdsvis), som kan knyttes til en lengre behandling av abasic nettsteder med Endonuclease VIII i forhold til en felles grunnleggende behandling med EDA., For det andre, det synes å være en svakere lengde diskriminering i cleavable regionen i forhold til UDG/EDA, med bare 20-25% forskjellen på de fleste mellom kort (10-nt) og lang (20-nt) dU-som inneholder regioner, når UDG alene behandling førte til store variasjoner i cleavage effektiviteten av de samme 10 og 20mers (opp til 50% forskjell). Igjen, er denne effekten kan skyldes forskjeller i behandlingen pris av AP nettsteder. Til slutt, dU homopolymers synes å være redusert i samme grad, uavhengig av linker eller substrat lengde., Denne mangelen på diskriminering i BRUKER-enzym tilfelle og i forhold til UDG-mediert spalting data tyder på at eksistensen av flere, sammenhengende AP nettsteder er den begrensende faktor i enzymatisk fjerning av AP nettsteder.

for Å oppsummere, i våre hender, vi fant ut at den beste spalting effektivitetsgevinster kan oppnås med UDG-mediert spalting etterfulgt av EDA behandling på lenger, ikke-homopolymeric uracil-inneholder underlag. Dermed enkelt-strandet sekvenser som inneholder 50%dU kan være effektivt spaltet, men i to trinn., En kort, ett-trinns behandling med BRUKEREN enzym cocktail kan også enkelt cleave opp til 50% av dU-som inneholder én tråder i en time, men tilsynelatende lavere diskriminerende effekt av denne spesielle enzymatisk behandling kan være mindre nyttig når en fortrinnsrett spalting er nødvendig.