Specificiteit en de Efficiëntie van de DNA-Uracil Glycosylase-Gemedieerde Strand Decolleté is Onderzocht op Grote Reeks Bibliotheken

UDG-gemedieerde uracil excisie en chemische AP site decolleté op microarrays

de DNA-streng decolleté gemedieerd door UDG bestaat uit twee aparte stappen: excisie van de base uracil gevolgd door splijting van de resulterende abasic site. De twee stappen kunnen afzonderlijk op microarrays van DNA worden gecontroleerd., Eerst, worden abasic plaatsen gegenereerd door de reeks met UDG te behandelen en in een tweede stap, wordt de bundel splitsing veroorzaakt door het blootstellen van de oppervlakte-gebonden, oligonucleotides van DNA die abasic plaatsen aan of zure of basisvoorwaarden bevatten, of door het verdampen van de oppervlakte aan droogheid. Dergelijke chemische strategieën om abasische plaatsen op de bundels van DNA te splitsen elimineren de behoefte aan extra enzymatische splitsing en staan voor UDG-kinetica toe onafhankelijk te worden bestudeerd., Hiertoe werden arrays van 30MER-DNA-sequenties met een toenemend aantal niet – opeenvolgende du-incorporaties (dU1-dU9) ontworpen en gesynthetiseerd door maskless nucleïnezuurfotolithografie, waarbij gebruik werd gemaakt van het overeenkomstige fotosensitieve du-fosforamidiet (Fig. 2). Elke bundel van DNA werd samengesteld met een dt15-linker aan de glasoppervlakte en geëindigd bij 5′-eind met een 25mer doelopeenvolging voor kruising (QC25), zoals vermeld in Fig. 3.,

de locatie van alle sondesequenties samen met overeenkomstige replicaten en controlestrengen die dT dragen in plaats van dU nucleotiden werd gerandomiseerd over het microarray-oppervlak., Voorafgaand aan enzymatische verwerking werden de sequenties van de DNA-sonde gehybridiseerd met het CY3-gelabelde complementaire 25mer oligonucleotide (QC25c) om de initiële waarden van de fluorescentieintensiteit te bepalen. De etikettering van 3 ‘ – Cy3 werd gebruikt om mogelijke fluorescentieartefacten toe te schrijven aan interactie van de kleurstof met het veranderlijke aantal dUs46 te verhinderen. Microarrays werden toen blootgesteld aan commercieel-sourced UDG van E. coli en de abasic plaats splitsing werd later uitgevoerd onder diverse voorwaarden. De optimale enzymblootstellingstijd werd bepaald in eerste experimenten. Onze resultaten (vijg., S1) tonen aan dat na toevoeging van het enzym de splitsingsefficiëntie met de tijd aanzienlijk toeneemt, tot een uur, en een efficiëntie van ongeveer 50-60% bereikt, met slechts lichte veranderingen bij verdere blootstelling aan UDG. Zo stellen we de optimale belichtingstijd in op één uur. Bovendien blijkt uit onze gegevens duidelijk dat de splitsingsefficiëntie is toegenomen met een toenemend aantal dU, van 40 tot 60% (Fig. 3C en S1).

We gingen vervolgens verder met het bestuderen van de eigenlijke splitsing stap, het verwijderen van de abasische site na excisie van de uracil base., Volgens bekende strategieën voor chemisch geïnduceerde abasische locatie splitsing in oplossing 20,30, werden de resulterende AP-sites vervolgens gesplitst ofwel onder alkalische omstandigheden door dompelen van de arrays in een 1: 1 (v/v) oplossing van ethyleendiamine(EDA)/ethanol, of de arrays werden behandeld onder zure omstandigheden door onderdompeling in een 30% (v/v) oplossing van trichloorazijnzuur in dichloormethaan, of door verdampen van het oppervlak van de arrays droog. In alle methoden werden de behandelingen uitgevoerd voor verschillende perioden, variërend van 1 tot 24 uur., Vervolgens werden de arrays opnieuw gehybrideerd tot de CY3-gelabelde complementaire 25mer oligonucleotide (QC25c) en werden de resulterende fluorescentie-intensiteiten vergeleken met die verkregen vóór UDG-behandeling om de splitsingsefficiëntie te bepalen. De resulterende splitsingssnelheden zijn aangegeven in Fig. 4.

onder basisomstandigheden (Fig. 4B), vereist de splitsing van AP-plaatsen een minimale incubatietijd van 2 uur om significante splitsing (40 tot 60%) van de substraten waar te nemen. Het is echter, behandeling van de array met een zuur of drogen het oppervlak (vijg., 4A, C, respectievelijk) resulteert in een duidelijke en uitgebreide splitsing na slechts één uur (30 tot bijna 80% bij een zure behandeling), wanneer EDA-gemedieerde abasische plaats splitsing minimaal is na één uur. Het is waarschijnlijk dat de splitsingsreactie zelf in a en c methodes in het definitieve kruising stadium wordt bevorderd, hetzij wegens temperatuur of aan de aanwezigheid van een amine in de buffer., Niettemin, aangezien de hybridisatie aan alle drie methodes gemeenschappelijk is, wijzen de grote verschillen in splitsingskinetiek tussen basis en niet-basisbehandelingen op de mogelijkheid dat extra plaatsen AP in aanwezigheid van een zuur, of onder verminderde druk kunnen worden geproduceerd, die extra posities op de bundels van DNA opleveren waarbij een volgende splitsingsreactie kan voorkomen. Langere behandelingen, ongeacht de methode, veranderen niet significant de mate van splitsing, meestal bijna 40% tot 80% afhankelijk van het aantal du incorporaties., We zien inderdaad een duidelijke algemene toename van de splitsingsefficiëntie met een toenemend aantal dU-incorporaties, onder alle geteste omstandigheden.

naast het uitvoeren van chemisch geïnduceerde DNA-bundel splitsing op abasische locatie locaties, werd de kwaliteit van het microarray oppervlak onderzocht. Voor dit doel, werd de uniformiteit van de eigenschappen op de serieoppervlakken visueel geïnspecteerd gebaseerd op fluorescentieintensiteiten en werd het verlies van fluorescentie voor de niet-splijt controlebundels gecontroleerd., We vonden dat abasische site splitsing onder alkalische omstandigheden toegestaan voor specifieke enzymgemedieerde splitsing van Du-bevattende sequenties, maar liet de controle sequenties vrijwel onaangetast, terwijl onder zure omstandigheden, DNA streng splitsing werd ook waargenomen voor controle strengen ontbreekt uracil nucleotiden (Fig. S2). Het drogen van het oppervlak leidde ook tot degradatie van de alleen-dT-controlestrengen. Omdat alleen abasische splitsing onder alkalische omstandigheden oppervlakteafbraak en niet-specifiek verlies van DNA voorkomt, hebben we alle volgende experimenten onder deze omstandigheden uitgevoerd., Dit zorgt ervoor dat de niet-splitsing controlesequenties beschikbaar blijven voor vergelijking, zelfs na lange chemische behandeling.

single – en double-stranded UDG sequentie dependence

omdat onze resultaten op E. coli UDG-gemedieerde du splitsing leverde slechts matige splitsing efficiëntie voor DNA strengen met enkele dU incorporaties (≈40%), we ondervroeg de sequentiespecificiteit van UDG om mogelijk een sterk gesplitst dU-bevattende substraat te identificeren. Hiervoor ontwierpen we een Du-bevattende nucleïnezuurbibliotheek van dubbel – en single-stranded DNA-sequenties., De bibliotheek bestaat uit een 7mer permutable sequentie met een enkele dU in het midden (Fig. 5). Permutatie van de 3-nt flankerende gebieden, 5′- en 3′ van de dU resulteert in 4096 unieke sequenties. In het dubbelstrengs formaat werden een lus en de complementaire sequentie van de 7mer toegevoegd, wat leidde tot de vorming van een haarspeldstructuur. Extra dG * dC-basenparen in de haarspeldpen hielpen bij het verhogen van de smelttemperatuur van de haarspeld DNA-structuur. Deze basisparen werden toegevoegd aan de single-stranded substraten om de ssdna en dsDNA ontwerpen zo vergelijkbaar mogelijk te houden., Tot slot werd 25mer oligonucleotide toegevoegd aan het 5 ‘ – eind van elk ontwerp om als kruisingdoel te dienen. Een representatieve figuur van de sequentieontwerpen wordt in de vijg getoond. 5.

hoewel terminaletikettering van DNA met een fluorescerende kleurstof een handige methode is om de fluorescentieintensiteit direct te meten, heeft het nadeel van hoge fluorescentie-ruis, wat, vooral bij microarrays met een hoge dichtheid, gegevensextractie en-interpretatie moeilijker maakt. Daarom besloten wij om de splitsingsreactie via hybridisatie aan de geà mmobiliseerde opeenvolgingen te controleren., Voorafgaand aan de behandeling met UDG werden de single – en double-stranded DNA-substraten gehybridiseerd met het geëtiketteerde complementaire 25mer oligonucleotide en gescand om initiële fluorescentiewaarden te verkrijgen. Dan, werden microarrays blootgesteld aan UDG voor verschillende tijdsperioden. Na de volgende AP-site splitsing onder alkalische omstandigheden, werden de arrays opnieuw gehybridiseerd om hun Cy3-gelabelde complementen. De daling van het fluorescentiesignaal van de bundels van DNA met betrekking tot de fluorescentiewaarden van de voorbehandeling komt direct aan splitsingsefficiency overeen., Maximale splitsingsefficiëntie van ongeveer 40% werd verkregen voor dubbelstrengs substraten na UDG-incubatie gedurende 2 minuten, en iets lagere splitsingssnelheden voor enkelstrengs substraten (tabel S1). Dit lagere tarief voor single-stranded weerspreekt eerdere studies die erop wijzen dat ze sneller dan hun double-stranded equivalenten worden gespleten 13,47,48. Interessant is dat zeer korte incubaties van enzymen (<1 min) nog steeds leiden tot significante splitsingsefficiëntie (30-35%)., Deze korte tijdspunten zijn vooral interessant omdat ze duidelijke hints geven van potentiële sequentievoorkeuren. Om sequentieafhankelijkheid in de UDG-gemedieerde DNA-degradatie van onze set van 4096 individuele strengen te identificeren, hebben we ons gericht op de 1% (Fig. 6) en 5% (Fig. S3) van de meest en minst gespleten subset van opeenvolgingen. Representatieve sequentiemotieven gegenereerd uit deze sequentiesubverzamelingen worden weergegeven in Fig. 6 en in de aanvullende informatie.,

voor dubbelstrengs DNA (Fig. 6A, B), tonen de resultaten een duidelijke voorkeur voor UDG-sequentie voor G/C-rijke regio ‘ s flankerend uracil. Omgekeerd lijkt UDG dubbelstrengsubstraten met T·A-basenparen slecht te verwerken. De motieven uit betere en armere UDG-substraten komen gedeeltelijk overeen met de zeer beperkte bestaande literatuurgegevens 48,49,50. Seibert et al., hypothesized dat de efficiëntie van E. coli UDG is gerelateerd aan de energetische kosten van DNA buigen en vervorming die in het proces van specifieke schadeherkenning voorkomen. In moleculaire dynamica simulaties en tijd-opgelost fluorescentie experimenten met twee uracil-bevattende double-stranded DNA sequenties, identificeerden zij dat de effectieve buigende kracht constanten lager zijn als dAs of dTs naast de uracil nucleotide, in plaats van dGs en dCs worden gevestigd; suggereren dat Da / DT-rijke sequenties gemakkelijker kunnen worden gebogen door UDG en dus beter processed49., Aangezien single-stranded DNA een veel flexibeler vorm van DNA is,zou zijn snellere verwerking die in de literatuur wordt gerapporteerd toe te schrijven aan de lagere energetische kosten van het splijten van substraten kunnen zijn die inherent flexibeler zijn dan dsDNA7,47,49, 51. Buigen kan echter niet een beslissende factor in UDG splitsing specificiteit van ssDNA, met het enzym herkennen en splitsen alle substraten even goed, die misschien verklaart de afwezigheid van sequentie consensus in Du-bevattende ssDNA., Er werd niettemin verondersteld dat de opeenvolgingscontexteffecten zich nog tot single-stranded DNA uitstrekken, en inderdaad voor UDG van herpes simplexvirus type 152 waren waargenomen, maar nog onduidelijk voor menselijke of E. coli UDG blijft. Slupphaug et al. gemeten de sequentiespecificiteit van menselijke UDG in 34 dsDNA-sequentiecontexten en vermoedde dat dT 3′ tot dU altijd resulteert in langzame verwijdering, net als, enigszins discordant, een hoog GC-gehalte50. Eftedal et al. evalueerde de splitsingsefficiëntie van zowel kalfsdymus als E. coli UDG van 41 dsDNA-sequenties en vond een vergelijkbaar patroon., Met onze veel grotere reeks sequenties kunnen we het erover eens zijn dat dT 3′ to dU altijd resulteert in langzame verwijdering, maar onze gegevens tonen duidelijk aan dat dC, en dG in mindere mate, 3’ to dU resulteert in snelle verwijdering. We waren niet in staat om significante sequentieafhankelijkheid voor du excision op ssDNA te identificeren (Fig. 6C, D). Opgemerkt moet worden dat de sequentieafhankelijkheid in dsDNA-substraten duidelijk is voor korte enzymatische behandelingen (5s, 30s, 60s en 120s), maar langzaam verdwijnt voor langere blootstelling aan UDG (30min), wat aangeeft dat alle substraten uiteindelijk worden gespleten wanneer ze worden blootgesteld aan het enzym.,

Decolleté site-optimalisaties

Aangezien er geen significante volgorde afhankelijkheid voor de UDG-gemedieerde uracil excisie op single-stranded DNA is ontstaan uit onze studies en tamelijk bescheiden decolleté efficiëntie voor één dU overnames verkregen werden, kozen we ervoor om te studeren UDG-gemedieerde dU excisie op meer single-stranded ondergronden met diverse vormen van meerdere dU overnames, gericht op het identificeren van specifieke splitsing sites die gemakkelijk afbreken toegankelijk en zorgen voor een snelle en efficiënte strand decolleté., Onze redenering is dat het vergroten van de afstand van de sonde tot het oppervlak moet zorgen voor een grotere toegankelijkheid voor de splitsing, maar dit effect kan niet worden overgedragen aan lange afstandhouders (>20-nt)53. Gebaseerd op de resultaten van Fig. 3, verwachten wij ook een hoger aantal van Du incorporaties om tot grotere algemene splitsing te leiden, maar wij vragen ons af of er een optimale dichtheid van Du nucleotiden binnen de splitsbare sectie van de bundel van DNA is. Daarom hebben we uracil splitsing onderzocht op langere du homopolymeren (10, 15 en 20mers) en op oligomeren met variërende %dU samenstelling., Het percentage dU binnen de oligomeer werd berekend ten opzichte van de andere vier nucleotiden (dA, dC, dG en dT) en experimenteel bereikt door koppelingsreacties uit te voeren met voorgemengde oplossingen van Du/dA/dC/dG/dT fosforamidieten in verschillende verhoudingen (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 of 100: 0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). De sequenties, gebouwd op poly – DT linkers van verschillende lengtes (dT1, dT5, dT10 en dT15), en het dU-bevattende gebied werden vervolgens beëindigd met een 25mer doelsequentie voor hybridisatie doeleinden zoals aangegeven in Fig. 7.,

na synthese werd het 25mer gehybridiseerd tot zijn complementaire 5′-Cy3 gelabelde oligonucleotide en werd de microarray gedurende 1 uur blootgesteld aan UDG., Daarna werd de abasische plaats opgesplitst onder alkalische omstandigheden, gevolgd door een definitieve herhybridizatie. Parallel hieraan voerden we ook de splitsingstest uit met het gebruikersenzym, wat in dit geval de noodzaak van een extra abasische splitsingsprocedure elimineert.

voor de enzymtest met UDG gevolgd door abasische splitsing van de plaats onder alkalische omstandigheden (Fig. 7, links), noteerden we splitsingsefficiëntie variërend van 4% tot 80% en met duidelijke trends in opkomst., De splitsingsefficiëntie neemt bijvoorbeeld aanzienlijk toe naarmate de lengte van de dU-bevattende regio toeneemt, in de orde 10mer > 15mer > 20mer, met een maximum van ~50% splitsing bereikbaar voor een 10mer dU regio, en 80% maximum voor de 20mer dU regio. Evenzo, langere linkers resulteert in een algemene hogere splitsing tarief. Deze waarnemingen geven aan dat langere opeenvolgingen beter worden herkend en de overeenkomstige uracilbasissen beter door UDG worden uitgesneden, die op zijn beurt een grotere toegankelijkheid van de langere substraten door het enzym voorstelt., De splitsingsefficiëntie wordt ook beà nvloed door de hoeveelheid du nucleotiden binnen het splitsbare deel van het substraat. Uracilhomopolymeren (100% dU)zijn bijna altijd minder gespleten dan hun congeneren met afgewisseld du-nucleotiden, en dit effect is vooral duidelijk wanneer de substraten worden gesynthetiseerd over een korte T1 linker. Aan de andere kant, het verhogen van de dU-inhoud van 12 naar 50% wordt voldaan met een toenemende splitsing efficiëntie, met 50% dU lijkt de optimale hoeveelheid., Dus, onder onze experimentele omstandigheden, UDG-gemedieerde splitsing was de meest efficiënte op de langste substraten waar de helft van de nucleotiden in het splitsbare deel dU zijn (80% splitsingsefficiëntie). Deze trend, evenals gegevens weergegeven in Fig. 3, stelt voor dat UDG aan veelvoudige du incorporaties kan erkennen en binden, zolang dUs door canonieke nucleotiden van DNA worden gescheiden.

hoewel korte homopolymeren over het algemeen bekend staan als slechte UDG-substraten, verwachten we ook lage splitsingspercentages voor de 20mer-splitsbare regio ‘ s waar te nemen, aangezien het onwaarschijnlijk is dat dergelijke substraten in DNA worden gevonden., In vivo komen uracilbasen voornamelijk voor in DNA-strengen als gevolg van misincorporatie tijdens replicatie of als gevolg van deaminatie8,9 en beide processen zullen waarschijnlijk niet met een dergelijke hoge frequentie optreden om homopolymeren te vormen. Niettemin werden matige tot hoge splitsingsefficiëntie van ongeveer 60% op lange 20mer dU-homopolymeren verkregen, maar of die homopolymeren langzamer worden verwerkt dan substraten met een lager %dU-gehalte, moet nog worden onderzocht.

het behandelen van een soortgelijke DNA array bibliotheek met het gebruikersenzymsysteem (Fig., 7, rechts) leidt tot bevredigende splitsing van single-stranded substraten, met splitsing trends enigszins vergelijkbaar met de UDG geval, maar met een paar opmerkelijke uitzonderingen. Ten eerste is de hoogste splitsingsefficiëntie lager dan voor het UDG/EDA-systeem (respectievelijk 55% versus 80%), wat kan worden toegeschreven aan een tragere verwerking van de abasische plaatsen met Endonuclease VIII in vergelijking met een gemeenschappelijke basisbehandeling met EDA., Ten tweede lijkt er een zwakkere lengtediscriminatie te zijn in de splitsbare regio in vergelijking met UDG/EDA, met hoogstens 20-25% verschil tussen korte (10-nt) en lange (20-nt) dU-bevattende regio ‘ s, wanneer de behandeling met UDG alleen leidde tot grote verschillen in de splitsingsefficiëntie van dezelfde 10 en 20mers (tot 50% verschil). Nogmaals, dit effect kan te wijten zijn aan verschillen in de verwerkingssnelheid van AP-sites. Ten slotte lijken de homopolymeren in dezelfde mate te worden afgebroken, ongeacht de linker-of substraatlengte., Dit gebrek aan discriminatie in het geval van GEBRUIKERSENZYMEN en vergeleken met UDG-gemedieerde splitsingsgegevens suggereert dat het bestaan van meerdere opeenvolgende AP-sites de beperkende factor is in de enzymatische verwijdering van AP-sites.

om samen te vatten, in onze handen, vonden we dat de beste splitsingsefficiëntie kan worden bereikt met de UDG-gemedieerde splitsing gevolgd door Eda-behandeling op langere, niet-homopolymeer uracil bevattende substraten. Daarbij kunnen single-stranded opeenvolgingen die 50% dU bevatten efficiënt worden gespleten, zij het in twee stappen., Een korte, single-step behandeling met de gebruiker enzymcocktail kan ook gemakkelijk splitsen tot 50% van dU-bevattende enkele strengen in een uur, echter, de ogenschijnlijk lagere onderscheidende kracht van deze specifieke enzymatische behandeling kan minder nuttig zijn wanneer een preferentiële splitsing is vereist.