pierwotnie opracowana w późnych latach 60., cytometria przepływowa jest popularną techniką analitycznej biologii komórki, która wykorzystuje światło do liczenia i profilowania komórek w heterogennej mieszaninie płynów. Cytometria przepływowa jest szczególnie potężną metodą, ponieważ pozwala badaczowi szybko, dokładnie i po prostu zbierać dane związane z wieloma parametrami z niejednorodnej płynnej mieszaniny zawierającej żywe komórki.,
cytometria przepływowa jest szeroko stosowana w naukach życiowych i biomedycznych i może być stosowana w każdym scenariuszu, w którym badacz musi szybko profilować dużą populację luźnych komórek w płynnym medium. Na przykład, w immunologii przepływ cytometrii używa utożsamiać, oddzielać i charakteryzować różne odpornościowe komórki podtypy pod względem ich wielkości i morfologii.
gdy wymagane są dodatkowe informacje, przeciwciała oznaczone barwnikami fluorescencyjnymi i podniesione przeciwko wysoce specyficznym antygenom powierzchni komórek (np., clusters of differentiation lub CD markers) mogą być używane do lepszej identyfikacji i segregacji określonych subpopulacji w obrębie większej grupy.
w Cytometrze przepływowym
- komórki próbki przepuszczane są pojedynczo przez wąski kanał.
- światło służy do oświetlania komórek w kanale.
- seria czujników wykrywa rodzaje światła, które są załamywane lub emitowane z komórek.
- dane pozyskane przez czujniki są kompilowane i integrowane w celu stworzenia kompleksowego obrazu próbki.,
- zbiory(1)
- (2)
- zbiory(1)
- zbiory(1)
- zbiory(3)
- (8)
- zbiory(1)
- kolekcji(1)
- zbiory(6)
- (6)
- przydziału(2)
- (6)
- Kolekcje(2)
różne rodzaje światła stosowane w eksperymencie cytometrii przepływowej
Cytometr przepływowy wykorzystuje załamane lub emitowane światło do liczenia i identyfikacji komórek. Dowiedz się o różnych rodzajach światła stosowanych w eksperymencie cytometrii przepływowej na poniższych rysunkach.,
światło rozproszone do przodu
światło rozproszone do przodu
światło rozproszone do przodu jest załamywane przez komórkę w kanale przepływu i kontynuowane wzdłuż ścieżki światła (tzn. w tym samym kierunku, w którym światło pierwotnie podróżowało). Światło rozproszone do przodu jest wykrywane przez czujnik w ścieżce światła i jest zwykle używane do identyfikacji wielkości cząstek.
światło rozproszone do przodu jest najczęściej używane do wykrywania rozmiaru obiektu w ścieżce światła., Większe obiekty wytwarzają więcej światła rozproszonego do przodu niż mniejsze obiekty, a większe komórki będą miały silniejszy sygnał rozproszenia do przodu
rozpraszacz boczny
rozpraszacz boczny
rozpraszacz boczny Światło przechodzi ze źródła oświetlenia do kanału przepływu, jest załamywane przez komórki w kierunku, który znajduje się poza oryginalną ścieżką światła. Światło rozproszone po bokach jest wykrywane przez czujnik, który jest prostopadły do oryginalnej ścieżki światła.,
światło boczne rozproszone jest zwykle używane do określenia ziarnistości i złożoności komórki w ścieżce światła. Wysoce ziarniste komórki o dużej złożoności wewnętrznej, jak neutrofile, wytwarzają więcej światła rozproszonego po stronie i wyższy sygnał rozpraszający po stronie niż komórki o niskiej ziarnistości i złożoności.
emisja fluorescencji
emisja fluorescencji
światło fluorescencyjne jest emitowane przez fluorescencyjne cząsteczki po wzbudzeniu przez kompatybilny laser o długości fali., Światło fluorescencyjne może pochodzić z naturalnie fluorescencyjnych materiałów w komórce, lub może pochodzić z fluorescencyjnych barwników lub znakowanych fluorescencją przeciwciał, które zostały użyte do oznaczenia określonej struktury na komórce.
Analiza Wieloparametryczna
Analiza Wieloparametryczna
makieta cytometrii przepływowej wykres punktowy, wykreślanie do przodu i z boku rozproszone z populacji leukocytów., Populacje komórek charakteryzują się ich prawdopodobną tożsamością:
L/M prawdopodobne leukocyty/monocyty, małe do średnich komórek o małej wewnętrznej złożoności/ziarnistości. Komórki te generują średnie rozproszenie w przód i niskie rozproszenie w stronę
granulocyty G, duże komórki o dużej wewnętrznej złożoności / ziarnistości. Komórki te generują wysokie sygnały rozpraszania w przód i w bok.,
podczas gdy niektóre tożsamości mogą być potwierdzone przez Profile do przodu i po bokach, etykietowanie z markerem specyficznym dla typu komórkowego zawsze zapewnia większą rozdzielczość i pewność podczas profilowania złożonych heterogenicznych populacji komórek.
na przykład na powyższym wykresie badacz może być w stanie rozróżnić granulocyty i limfocyty za pomocą światła rozproszonego do przodu i do boku. Jednak trzy klasy granulocytów (neutrofile, bazofile i eozynofile) są bardzo podobne pod względem wielkości i struktury, dając im podobne właściwości rozpraszania światła., W tym przypadku neutrofile mogą być selektywnie oznaczane przez ich ekspresję markerem specyficznym dla neutrofilów, takim jak ELAN.
FACS: sortowanie komórek na podstawie danych z cytometrii przepływowej
terminy cytometria przepływowa i sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) są często używane zamiennie. W praktyce istnieją różnice między tymi dwoma metodami.
FACS jest pochodną cytometrii przepływowej, która dodaje wyjątkowego stopnia funkcjonalności. Korzystanie FACS badacz może fizycznie sortować heterogeniczną mieszankę komórek w różnych populacjach.,
używając wysoce specyficznych przeciwciał oznaczonych barwnikami fluorescencyjnymi, badacz może przeprowadzić analizę FACS i jednocześnie zebrać dane na temat i posortować próbkę przez prawie nieograniczoną liczbę różnych parametrów.
w eksperymencie FACS:
- gromadzone są dane rozpraszające do przodu, rozpraszające do boku i fluorescencyjne, tak jak w konwencjonalnej cytometrii przepływowej.
- parametry zdefiniowane przez użytkownika dostarczają informacji o tym, jak komórki powinny być sortowane.
- na podstawie tych parametrów maszyna FACS wykorzystuje elektrodę do nakładania ładunku elektrycznego na każde ogniwo.,
- Po wyjściu z komory przepływowej Elektromagnesy posortują komórki według ładunku do oddzielnych naczyń.
jak wyglądają dane z cytometrii przepływowej?
w eksperymencie cytometrii przepływowej każda komórka, która przechodzi przez cytometr przepływowy i zostanie wykryta, zostanie sklasyfikowana jako odrębne Zdarzenie.
dodatkowo, każdemu rodzajowi światła, które jest wykrywane przez cytometr przepływowy (rozpraszacz do przodu, rozpraszacz boczny i każda długość fali emisji fluorescencji) zostanie przypisany własny, unikalny kanał., Dane z cytometrii przepływowej będą rysować każde zdarzenie niezależnie i będą reprezentować intensywność sygnału światła wykrytego w każdym kanale dla każdego zdarzenia.
dane z cytometrii przepływowej są zazwyczaj reprezentowane na dwa sposoby: histogramy, które mierzą lub porównują tylko jeden parametr, i kropki, które porównują 2 lub 3 parametry jednocześnie na dwu-lub trójwymiarowym wykresie punktowym.
histogram zazwyczaj przedstawia intensywność wykrytą w jednym kanale wzdłuż jednej osi, a liczba zdarzeń wykrytych przy tej intensywności znajduje się w oddzielnej osi., Duża liczba zdarzeń wykrytych przy określonej intensywności będzie wyświetlana jako skok na histogramie.
natomiast na wykresie punktowym każde zdarzenie jest reprezentowane jako pojedynczy punkt na wykresie punktowym. Natężenie 2 różnych kanałów (lub 3 różnych kanałów w trójwymiarowym wykresie) są reprezentowane wzdłuż różnych osi. Wydarzenia o podobnej intensywności skupią się w tym samym regionie na wykresie rozproszonym.
Uwaga: w danych z wykresu kropkowego duże próbki często spowodują dużą grupę zdarzeń reprezentowanych w tym samym regionie wykresu., Istnieje wiele metod dodawania dodatkowej rozdzielczości do tych regionów. Na przykład, mapa ciepła, jak w powyższym przykładzie, może być używana do dostarczania informacji o gęstości zdarzeń w danym regionie wykresu.
histogramy i wykresy kropkowe zapewniają różne zalety analizy danych cytometrii przepływowej. Wybór najlepszego sposobu reprezentacji danych może pomóc w zapewnieniu, że opowiadają one kompletną historię w prostym, zrozumiałym formacie.
histogramy
- są szybkie do odczytania i łatwe do zrozumienia.
- są najbardziej przydatne, gdy tylko jeden parametr (np., natężenie z jednego kanału fluorescencyjnego) jest ważne.
- zwykła reprezentacja obejmuje intensywność pojedynczego kanału (oś pozioma) w stosunku do liczby wykrytych zdarzeń (oś pionowa).
- wielokrotne nakładane histogramy mogą być użyte do porównania pojedynczego parametru z dwóch różnych populacji próbek (np. eksperymentalnych vs. kontroli).
wykresy punktowe
- są najbardziej przydatne, gdy trzeba porównać dane wieloparametryczne (np. natężenie kanałów rozpraszających boki i rozpraszających do przodu).,
- może być dwu – lub trójwymiarowy
- intensywność każdego kanału jest reprezentowana na własnej osi.
- każde odrębne zdarzenie jest reprezentowane w jednej kropce.
- są bardziej złożoną, bardziej obrazową reprezentacją danych.
kropki i histogramy nie wykluczają się wzajemnie, a większość złożonych eksperymentów cytometrii przepływowej wykorzysta wiele wykresów do wyświetlania bogatych, wieloparametrycznych danych na próbce.
w wielu przypadkach należy wykreślić więcej niż trzy parametry jednocześnie., W tym przypadku technika analizy danych znana jako gating może pomóc w uzyskaniu dodatkowej rozdzielczości i elastyczności, pozwalając na analizę niemal nieograniczonej ilości parametrów jednocześnie w kilku różnych wykresach i histogramach.
Gating dodaje Rozdzielczość do danych cytometrii przepływowej
w skrócie, gating jest metodą wyboru komórek z eksperymentu cytometrii przepływowej, które chcesz przeanalizować bardziej szczegółowo., Gating pozwala badaczowi zebrać i wyświetlić więcej informacji na temat subpopulacji komórek, niż normalnie może być wyświetlany na 2-lub 3-wymiarowym wykresie punktowym.
Gating dodaje rozdzielczość do eksperymentu cytometrii przepływowej i pozwala na jednoczesną analizę niemal nieograniczonej liczby różnych parametrów (kanałów).
w ogrodzonym eksperymencie cytometrii przepływowej:
- użytkownik zbiera dane z cytometrii przepływowej z jednego lub więcej kanałów na wykresie punktowym.
- na podstawie uzyskanych danych, użytkownik rysuje pole bramy wybierając subpopulację komórek do dalszej analizy.,
- subpopulacja komórek w bramce będzie specjalnie podświetlona na innych wykresach wyświetlających informacje z alternatywnych kanałów.
Gates dodaje niesamowitą elastyczność cytometrii przepływowej, przyznając do rozdzielczości jednokomórkowej dla każdego kanału dostępnego badaczowi. Wiele bramek mogą ustanawiać dla pojedynczego scatter-plot, i bramki mogą być „stacked” i łączone (to znaczy subpopulacja komórek gated dla w kanałach 1 i 2 może być dalej gated dla kanałów 3 i 4, aby umożliwić większą specyficzność i głębszą analizę).,
przykład bramkowania
przykład bramkowania. Na obrazie dwie subpopulacje komórek są bramkowane na podstawie ich profili intensywności rozpraszania w przód i w bok.
ta sama populacja komórek jest wyróżniona spójnym schematem kolorów podczas analizy dwóch różnych kanałów mierzących natężenie fluorescencji na powyższym obrazku.,
uwaga na temat kompensacji
przelanie z jednego kanału na drugi może powodować fałszywie jako pozytywne zidentyfikowane sygnały. Spillover to artefaktowy sygnał, który jeden fluorescencyjny barwnik może powodować w kanale innego fluoroforu jako funkcja jego względnej jasności i widma emisyjnego. Tu właśnie wchodzi w grę rekompensata. Kompensacja jest procedurą, która izoluje sygnał z jednego konkretnego kanału od innych kanałów używanych w tym samym eksperymencie. FITC np., ma swój szczyt emisji w zielonym zakresie widma elektromagnetycznego. Ma jednak również fluorescencję w żółtym kanale, w którym PE emituje światło. Mówiąc najprościej, kompensacja odejmuje sygnał FITC z kanału PE.
ten sygnał w „złym” kanale jest odejmowany od sygnału wywołanego przez interesujący fluorofor. W powyższej próbce stosunek składnika zielonego i żółtego przy danej długości fali wzbudzenia jest stały dla FITC., Możliwe jest zatem wnioskowanie ilości niespecyficznego żółtego sygnału FITC w kanale PE z pomiaru w kanale zielonym za pomocą współczynników stałej kompensacji. To samo dotyczy wycieku z PE do kanału FITC.