elektroforeza żelowa DNA jest techniką stosowaną do oddzielania i identyfikacji fragmentów DNA na podstawie rozmiaru.
fragmenty DNA różnej wielkości są ładowane do porowatego żelu z agarozy – węglowodanu występującego w czerwonych glonach.
po przyłożeniu pola elektrycznego fragmenty będą migrować przez żel, dzięki ujemnie naładowanym grupom fosforanowym w nukleotydach DNA.
mniejsze fragmenty DNA łatwiej migrują przez żel niż większe fragmenty, które mają trudniejszy czas poruszania się przez matrycę żelową.,
Po zakończeniu biegu żelu lokalizacja próbek DNA może być porównana z serią fragmentów lub pasm o znanych rozmiarach, zwanych drabiną DNA.
obecność interesującego cię fragmentu można następnie potwierdzić na podstawie jego wielkości, która jest określana przez porównanie względnej lokalizacji próbki testowej z fragmentami drabiny.
żele Agarozowe są przygotowywane przy użyciu roztworu procentowego o masie powyżej objętości. Tak więc 1 gram agarozy w 100 ml buforu stworzy 1% żelu., Niższy procent żeli lepiej rozwiązuje większe fragmenty, a wyższy procent żeli ułatwi identyfikację mniejszych fragmentów. Aby rozpocząć procedurę wytwarzania żelu, należy zważyć odpowiednią masę agarozy do kolby Erlenmeyera.
Dodaj uruchomiony bufor do kolby, tak aby objętość bufora nie była większa niż 1/3 pojemności kolby. Następnie zawirować, aby wymieszać.
stopić mieszaninę agarozowo-buforową przez ogrzewanie w kuchence mikrofalowej o maksymalnej mocy. Co trzydzieści sekund wyjmować kolbę i obracać zawartość, aby dobrze wymieszać. Powtarzać czynność aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy.,
następnie dodać bromek etydyny do stężenia 0, 5 mg / ml. Bromek etydyny jest związkiem aromatycznym, który pasuje między poszczególnymi parami zasad DNA lub interkalatami i powoduje, że DNA emituje intensywną pomarańczową fluorescencję w świetle UV. Ważne jest, aby pamiętać, że bromek etydyny jest czynnikiem rakotwórczym, dlatego rękawice powinny być zawsze noszone podczas obchodzenia się z żelami zawierającymi ten związek.
aby zapobiec wypaczeniu się tacki żelowej, pozostawić agarozę do ostygnięcia, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 65ºC.
gdy agaroza stygnie, przygotuj formę żelową, umieszczając tacę żelową w aparacie odlewniczym., Alternatywnie można użyć taśmy do uszczelnienia otwartych krawędzi zasobnika żelu, aby utworzyć formę. Umieszczenie grzebienia w żelu tworzy studnie, w których ładuje się DNA. Upewnij się, że grzebień stworzy studnię o odpowiednim rozmiarze dla próbki DNA.
wlać stopioną agarozę do formy żelowej i pozostawić do stwardnienia w temperaturze pokojowej.
po stwardnieniu agarozy wyjmij grzebień. Jeśli żel nie zostanie natychmiast zużyty, zawiń go w folię i przechowuj w temperaturze 4ºC do czasu użycia.
Jeśli żel ma być użyty natychmiast, umieść go w pudełku z żelem.,
aby rozpocząć tę procedurę, dodaj barwnik ładujący żel do próbek DNA, które mają być oddzielone. Barwnik ładujący jest zwykle wytwarzany w stężeniu 6X. Ładowanie barwnika pomaga wizualizować i ładować próbki do studni i pomaga określić, jak daleko próbki zostały przeniesione podczas biegu.
Ustaw zasilanie na żądane napięcie.
teraz dodaj wystarczająco dużo bufora do pudełka żelu, aby pokryć powierzchnię żelu. Upewnij się, że używasz tego samego bufora do biegania, co ten użyty do przygotowania żelu.
Podłącz przewody pudełka żelowego do zasilacza i włącz go., Pamiętaj, że DNA jest ujemnie naładowane i będzie poruszać się w kierunku anody, która jest dodatnia, i ogólnie czerwony kolor. Upewnij się, że nie podłączasz czarnego ołowiu lub katody do dna pudełka z żelem. Więc nie zapominaj, pamiętaj, że czarne koty to pech, lub negatywne, a czarna katoda jest zatem negatywna. Przeprowadź żel na czerwono lub anodę. Aby sprawdzić, czy zarówno pudełko żelowe, jak i zasilacz działają; pojawienie się pęcherzyków na elektrodach wskazuje, że prąd przechodzi.
zdjąć pokrywę pudełka z żelem., Powoli i ostrożnie załaduj próbki DNA do żelu. Ponownie, barwnik ładujący w próbce pozwala próbce zanurzyć się w żelu i pomoże śledzić, jak daleko próbka przebyła. Marker wielkości DNA, lub drabina, powinny być zawsze ładowane wraz z próbek eksperymentalnych.
Wymień pokrywę. Sprawdź dokładnie, czy elektrody są podłączone do odpowiednich gniazd w zasilaczu.
włącz zasilanie. Uruchom żel, aż barwnik przeniesie się na odpowiednią odległość.
Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilanie i zdejmij pokrywę pudełka z żelem.,
Usuń żel z pudełka żelowego i spuść nadmiar buforu na powierzchnię żelu. Umieść tacę z żelem na ręcznikach papierowych, aby wchłonąć pozostały bufor.
aby wizualizować fragmenty DNA, wyjmij żel z tacki na żel i wystaw żel na działanie ultrafioletowego światła.
fragment DNA powinien pojawiać się jako pomarańczowe pasma fluorescencyjne. Zrób zdjęcie żelu.
Po zakończeniu eksperymentu należy odpowiednio pozbyć się żelu i uruchomić bufor zgodnie z przepisami instytucji. Ponownie, pamiętaj, aby zawsze obchodzić się z żelem i buforami biegowymi za pomocą rękawiczek, aby uniknąć narażenia na bromek etydyny.,
teraz, gdy widziałeś, jak wykonać elektroforezę w żelu DNA. Przyjrzyjmy się kilku kolejnym aplikacjom i odmianom tej wysoce użytecznej metody.
tutaj widzisz wynik elektroforezy w żelu agarozowym po oddzieleniu produktów PCR. Fragmenty DNA załadowane do żelu są widoczne jako wyraźnie określone pasma. Standard DNA lub drabina powinny być oddzielone w stopniu pozwalającym na użyteczne określenie rozmiarów pasm próbek. W tym przykładzie fragmenty DNA 765 par zasad, 880 par zasad i 1022 par zasad są rozdzielone na 1.,5% żel agarozowy z drabiną 2-log DNA.
oprócz potwierdzenia obecności interesującego fragmentu DNA, elektroforezę żelu DNA można łączyć z procedurami oczyszczania żelu. Zazwyczaj ostrze żyletki jest używany do wycięcia fragmentu DNA zainteresowania, tak, że można go pobrać i próbki DNA w nim odzyskane.,
Elektrofeza w żelu agarozowym może być również łączona z transfer blotting, który polega na umożliwieniu DNA lub RNA przeniesienia do błony celulozowej, gdzie sondy radioaktywne mogą być używane do identyfikacji określonych sekwencji DNA lub RNA w elektroforetycznie oddzielonej próbce.
Standardowa elektroforeza żelowa DNA nie jest idealna do rozdzielania DNA o dużej masie cząsteczkowej większej niż 15-20 kb, podobnie jak genomowe DNA. Aby oddzielić duże próbki DNA, stosuje się elektroforezę pola impulsowego, która polega na poddaniu żelu zmieniającemu się lub pulsującemu polowi elektrycznemu w różnych kierunkach., Technika ta polega na specjalistycznym urządzeniu do biegania żelu, który ma pary elektrod ułożonych w różnych kierunkach wokół żelu. Można to wykorzystać do wykrycia różnic w rozmiarach genomu między populacjami organizmów, takich jak zbiorcze próbki DNA z różnych społeczności mikrobiologicznych, które są pobierane z różnych środowisk jeziornych.
właśnie zobaczyłeś wprowadzenie do elektroforezy żelu DNA., Pokazaliśmy koncepcję metody, jak przygotować żel agarozowy, jak załadować próbki, jak uruchomić żel i przeanalizować go oraz niektóre typowe zastosowania elektroforezy w żelu agarozowym. Dzięki za oglądanie i powodzenia w prowadzeniu żelu.