SDS-PAGE (siarczan dodecylu sodu-elektroforeza żelu poliakrylamidowego) jest powszechnie stosowany w laboratorium do oddzielania białek na podstawie ich masy cząsteczkowej. Jest to jedna z tych technik, która jest powszechnie stosowana, ale nie często w pełni zrozumiała. Spróbujmy to naprawić.
SDS-strona rozdziela białka według ich masy cząsteczkowej, na podstawie różnicowych szybkości ich migracji przez matrycę sitową (żel) pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego.,
czyniąc szybkość migracji białek proporcjonalną do masy cząsteczkowej
ruch dowolnego naładowanego gatunku przez pole elektryczne jest określony przez jego ładunek netto, jego promień cząsteczkowy i wielkość zastosowanego pola. Jednak problem z natywnie złożonymi białkami polega na tym, że ani ich ładunek netto, ani ich promień cząsteczkowy nie są zależne od masy cząsteczkowej. Zamiast tego ich ładunek netto jest określany przez skład aminokwasów, tj. sumę dodatnich i ujemnych aminokwasów w białku i promieniu molekularnym przez strukturę trzeciorzędową białka.,
tak więc w ich naturalnym stanie różne białka o tej samej masie cząsteczkowej migrują z różnymi prędkościami w polu elektrycznym w zależności od ich ładunku i kształtu 3D.
aby oddzielić białka w polu elektrycznym tylko na podstawie ich masy cząsteczkowej, musimy zniszczyć strukturę trzeciorzędową poprzez redukcję białka do liniowej cząsteczki i jakoś maskować wewnętrzny ładunek netto białka. Tu wkracza SDS.,
rola SDS (et al)
SDS jest detergentem, który jest obecny w buforze próbek SDS-PAGE, gdzie wraz z odrobiną wrzenia i środkiem redukującym (Zwykle DTT lub B-ME do rozkładania wiązań dwusiarczkowych białka-białka), zaburza trzeciorzędową strukturę białek. To sprowadza złożone białka do liniowych cząsteczek.
SDS pokrywa również białko jednolitym ładunkiem ujemnym, który maskuje wewnętrzne ładunki w grupach R. SDS wiąże się dość równomiernie z białkami liniowymi (ok.,4G SDS / 1G białka), co oznacza, że ładunek białka jest teraz w przybliżeniu proporcjonalny do jego masy cząsteczkowej.
SDS jest również obecny w żelu, aby upewnić się, że po linearyzacji białek i zamaskowaniu ich ładunków, pozostają w ten sposób przez cały czas trwania cyklu.
dominującym czynnikiem w określaniu białka pokrytego SDS jest jego promień molekularny., Wykazano, że białka pokryte SDS są cząsteczkami liniowymi, o szerokości 18 kątów i długości proporcjonalnej do ich masy cząsteczkowej, więc promień cząsteczkowy (a tym samym ich mobilność w żelu) jest określony przez masę cząsteczkową białka. Ponieważ białka pokryte SDS mają ten sam stosunek ładunku do masy, nie będzie różnicowej migracji opartej na ładunku.
Matryca żelowa
w przyłożonym polu elektrycznym białka poddane działaniu SDS będą teraz poruszać się w kierunku anody dodatniej z różną szybkością w zależności od ich masy cząsteczkowej., Te różne możliwości przenoszenia będą przesadzone ze względu na środowisko o wysokim tarciu matrycy żelowej.
jak sama nazwa wskazuje, matryca żelowa używana do SDS-PAGE to poliakryloamid, który jest dobrym wyborem, ponieważ jest chemicznie obojętny i, co najważniejsze, można go łatwo uzupełnić w różnych stężeniach, aby uzyskać różne rozmiary porów, dając różne warunki oddzielania, które można zmienić w zależności od potrzeb. Być może pamiętacie, że wcześniej pisałem artykuł o mechanizmie polimeryzacji akrylamidu.,
nieciągły system buforowy i układanie żelu – układanie ich na linii startowej
aby przeprowadzić prąd z katody (ujemnej) do anody (dodatniej) przez żel, oczywiście potrzebny jest bufor. Najczęściej używamy nieciągłego systemu buforów Laemmli. „Nieciągły” oznacza po prostu, że bufor w żelu i zbiornik są różne.
zazwyczaj system jest konfigurowany z żelem do układania w stos przy pH 6.8, buforowanym przez Tris-HCl, żelem do biegania buforowanym do pH 8.8 przez Tris-HCl i buforem elektrody przy pH 8.3., Żel do układania w stosy ma niskie stężenie akrylamidu, a żel do układania w stosy wyższe stężenie zdolne do opóźniania ruchu białek.
więc o co chodzi z tymi wszystkimi różnymi pH?
cóż, glicyna może występować w trzech różnych stanach naładowania, dodatnich, neutralnych lub ujemnych, w zależności od pH. pokazano to na poniższym diagramie. Kontrola stanu naładowania glicyny przez różne bufory jest kluczem do całego układania żelu.,
oto jak działa żel do układania. Po włączeniu zasilania ujemnie naładowane jony glicyny w buforze elektrody pH 8.3 są zmuszone do wejścia do żelu układającego, gdzie pH wynosi 6,8. W tym środowisku glicyna przechodzi głównie w stan zwitterionowy (naładowany neutralnie). Ta utrata ładunku powoduje, że poruszają się bardzo wolno w polu elektrycznym.
jony Cl (od Tris – HCl) z drugiej strony poruszają się znacznie szybciej w polu elektrycznym i tworzą przód jonowy, który migruje przed glicyną., Oddzielenie CL-od przeciw – jonu Tris (który teraz porusza się w kierunku anody) tworzy wąską strefę ze stromym gradientem napięcia, który ciągnie glicynę za sobą, powodując dwa wąsko oddzielone fronty migrujących jonów; wysoce mobilny front Cl, a następnie wolniejszy, w większości neutralny front glicyny.,
wszystkie białka w próbce żelu mają mobilność elektroforetyczną, która jest pośrednią między skrajnością mobilności glicyny i Cl- , więc gdy dwa fronty przebijają się przez próbkę, białka są skoncentrowane w wąskiej strefie między frontami CL-i glicyny.
i ruszyli!
procesja ta trwa aż do momentu, gdy uderzy w żel biegowy, gdzie Ph zmienia się na 8,8. Przy tym pH cząsteczki glicyny są w większości ujemnie naładowane i mogą migrować znacznie szybciej niż białka., Tak więc przód glicyny przyspiesza omijając białka, pozostawiając je w pyle.
w rezultacie białka są wyrzucane w bardzo wąskim paśmie na styku żeli do układania i żeli do biegania, a ponieważ żel do biegania ma zwiększone stężenie akrylamidu, co spowalnia ruch białek w zależności od ich wielkości, rozpoczyna się oddzielanie.
o co w tym wszystkim chodziło?
Jeśli nadal zastanawiasz się, dlaczego żel do układania jest potrzebny, pomyśl, co by się stało, gdybyś go nie użył.,
studnie żelowe mają głębokość około 1 cm i zazwyczaj trzeba je znacznie wypełnić, aby uzyskać wystarczającą ilość białka na żel. Tak więc w przypadku braku żelu do układania w stosy próbka siedziałaby na wierzchu żelu do biegania, jako pasmo o głębokości do 1 cm.
zamiast być ustawionym razem i uderzać w żel do biegania, oznaczałoby to, że białka w próbce wejdą do żelu do biegania w różnym czasie, powodując bardzo rozmazane pasma.,
tak więc żel do układania zapewnia, że wszystkie białka docierają do biegnącego żelu w tym samym czasie, więc białka o tej samej masie cząsteczkowej będą migrować jako ciasne pasma.
separacja
gdy białka znajdują się w biegnącym żelu, są oddzielane, ponieważ białka o wyższej masie cząsteczkowej poruszają się wolniej przez porowaty żel akrylamidowy niż białka o niższej masie cząsteczkowej. Wielkość porów w żelu może być zmieniana w zależności od wielkości białek, które chcesz oddzielić, zmieniając stężenie akrylamidu. Typowe wartości przedstawiono poniżej.,
dla szerszego zakresu oddzielania lub dla białek, które są trudne do oddzielenia, można użyć gradientowego żelu, który ma warstwy zwiększającego się stężenia akrylamidu.