ocena Pulmonologiczna. Badania czynnościowe płuc (PFT) wykonano za pomocą spirometru Brentwood w naszym gabinecie. Niektórzy pacjenci przeszli badania gdzie indziej.
testy immunologiczne. Badania wykonano w laboratoriach immunologicznych pod kierunkiem dr A. Wojdani.. Ze względu na znaczenie tych testów w kontekście tej oceny, metodologia została szczegółowo opisana.,
przygotowanie koniugatów Formaldehydu-ludzkiej albuminy surowicy (F-HSA) i formaldehydu-bydlęcej albuminy surowicy (F-BSA):
w celu określenia wystąpienia koniugacji przeprowadzono porównanie elektroforetyczne i immunoelektroforetyczne HSA, BSA z F-HSA i F-BSA. Koniugacja była potwierdzona zmienioną mobilnością F-HSA, F-BSA, gdy porównywano ją odpowiednio z HSA lub BSA. Ponadto liczbę wolnych grup aminowych obecnych w F-HSA lub F-BSA wyznaczono metodą Snydera i Sobocińskiego (1975) i wykorzystano do oceny ilości substytucji., Liczba grup aminowych związanych z formaldehydem wynosiła 26 dla HSA i 31 DLA BSA. W obliczeniach tych rozważano tworzenie sieciowania międzycząsteczkowego.
przygotowanie koniugatów diizocyjanianu toluenu-albuminy surowicy ludzkiej (TDI-HSA) i albuminy surowicy bydlęcej (TDI-BSA):
preparat ten był podobny do metod Dewara i Baura (1982). Zgodnie z tą metodą 1G HSA lub 1G BSA rozpuszczono w 100 ml roztworu buforowego zawierającego chlorek potasu (0,05 mol/l), boran sodu (0,05 mol / l), PH 9,4 i schłodzono do 4 C. dioksan (10 ml) zawierający 0.,Następnie 15 ml diizocyjanianu toluenu dodawano kroplami, mieszając przez okres 3 godzin, a następnie dodano 2 ml etanoloaminy, odwirowanie, filtrację dializacyjną i liofilizację. Podobnie jak F-HSA i F-BSA, koniugacja została potwierdzona elektroforezą i oznaczeniem wolnych grup aminowych obecnych w koniugacie. Liczba grup aminowych związanych z TDI wynosiła 37 dla HSA i 43 dla BSA. Ponadto przeprowadzono analizę spektrograficzną koniugatu według Zeiss et. al. (1980)., Nastąpił znaczny wzrost absorpcji z 230 do 260 nm, co wskazywało, że TDI zostało kowalencyjnie połączone z nośnikiem białka. Ten wzrost wchłaniania zgadzał się z oznaczeniem grupy NH2 tylko 76% dla HSA i 81% Dla BSA
przygotowanie bezwodnika trimelitowego-albuminy surowicy ludzkiej (TMA-HSA) i bezwodnika trimelitowego albuminy surowicy bydlęcej (TMA-BSA):
przygotowanie tych koniugatów w dawce 25 mg. TMA rozpuszczono w 0,5 ml dioksanu i dodano kroplowo do 25 mg HSA lub BSA rozpuszczonego w 5 ml zimnego 7% NaHCO3 w wodzie., Po mieszaniu przez 60 minut w temperaturze 4 ° C koniugaty były dializowane wobec czterech zmian 0,1 M NaHCO3 i jednej zmiany bufora. Ostatecznie koniugaty były filtrowane i utrzymywane w temperaturze -20 C, aż do użycia. Przeprowadzono analizy TMA-HSA i TMA-BSA w celu określenia liczby pozostałości TMA związanych z odpowiednim białkiem nośnikowym. Stężenie białka nośnika zostało przekształcone w stężenie molowe o masie cząsteczkowej HSA i BSA. Na podstawie stosunku stężenia molowego ligandu TMA i nośnika białka obliczono stosunek pozostałości TMA na cząsteczki nośnika., Szacuje się, że TMA-HSA zawiera 5 reszt TMA na cząsteczki HSA, a dla TMA-BSA siedem reszt na cząsteczkę albuminy (Pien et al., 1988).
przygotowanie koniugatów bezwodnika ftalowego z albuminą surowicy ludzkiej (PA-HSA) i bezwodnika ftalowego z albuminą surowicy bydlęcej (Pa-BSA):
te koniugaty haptenu były przygotowywane przez dodanie 75 mg PA do schłodzonego roztworu 300 mg HSA lub BSA w 100 ml H2O. mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc, dializowano przeciwko 0,1 M PBS za pomocą rurek o odcięciu 8000 Daltonów. Stosując metodę Zeiss et. al. (1977) obliczono współczynniki molowe., Współczynniki molowe ustalono na 22/28 dla PA / HSA i 25/30 dla PA / BSA.
przygotowanie koniugatów pierścienia benzenowego HSA (B-HSA) i pierścienia benzenowego BSA (B-BSA):
dla tych preparatów, 40 mg. kwas p-aminobenzoesowy rozpuszczono w 2 ml 1 N HCL i chłodzono przez zanurzenie w łaźni lodowej. Dodano kroplami zimny roztwór o stężeniu 14 mg/ml. Po każdym dodaniu mieszaninę mieszano przez 30 sekund. Równolegle jeden gram HSA lub BSA rozpuszczono w kwasie borowym 0,16 m bufora chlorku sodu (0-15 M) PH 9,0 (pH podniesiono z NaOH)., Zlewki zawierające roztwory albumin były otoczone łaźnią lodową na mieszadle magnetycznym. Roztwór soli diazoniowej dodawano kroplami, z szybkim mieszaniem do zimnego roztworu białka. Po dodaniu każdej kropli PH jest dostosowywane do 9,0 do 9,5 z jednym normalnym NaOH. Po dodaniu całego roztworu można było kontynuować reakcję z powolnym mieszaniem przez co najmniej godzinę z dalszymi dodatkami roztworu NaOH i utrzymaniem PH w zakresie od 9,0 do 9,5., Nieaktywne małe cząsteczki zostały usunięte przez intensywną dializę lub przejście przez kolumnę sefadeksu G-25 w zimnym pomieszczeniu, z izotonicznym roztworem soli jako buforem elutującym. Analizy od rozwoju pomarańczowego koloru B-HSA i B-BSA przeprowadzono w celu określenia liczby pozostałości B związanych z odpowiednim białkiem nośnikowym. Liczba BSA dla HSA wynosiła około 41, A Dla BSA 53 (Migradichian, 1957).
oznaczanie przeciwciał:
swoiste przeciwciała przeciwko F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA i B-HSA analizowano przy użyciu niekonkurencyjnego testu ELISA., Studzienki płyt mikrotiterowych (Dynatech, Alexandria, VA) pokryto 100 1 roztworami antygenu (100 g / ml) w 0,1 M PBS PH 7,2 na noc w temperaturze 4 ° C. płyty przemyto 4 razy z 0,1 M PBS zawierającym 0,05% tween 20 między każdym etapem. Wolne miejsca wchłaniania Zablokowano 2% wolną od proteazy albuminą surowicy bydła w temperaturze pokojowej przez 4 godziny i przechowywano w temperaturze -20 ° C do czasu użycia.,
procedura analityczna:
procedura obejmowała: (1) 4-krotne przemywanie, (2) dodanie 100 1 rozcieńczonej surowicy (1:2 dla IgE i 1:100 dla IgM i IgG) w PBS tween-20 z 1% BSA (3) inkubacja przez 4 godziny w temperaturze 20 ° C, a następnie 4-krotne przemywanie, (4) dodanie 100 1 optymalnego rozcieńczenia fosfatazy alkalicznej oznaczonej powinowactwem oczyszczona Koza anty-ludzka IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) i anty IgG (1:1000), zakupione od KPI (Maryland) (5) inkubacja przez 120 minut w temperaturze 20 ° C, (6) pranie 6 razy, (7) dodanie 100 1 fosforanu p-nitrofenylu (Sigma Chemical Co.,) (8) inkubacja przez 60 minut w temperaturze 20 ° C (9) dodanie 50 1 z 3 N roztworu wodorotlenku sodu, oraz (10) ponowne odczytanie. Wyniki zostały obliczone na podstawie absorpcji duplikatów próbek o długości 405 nm przy użyciu czytnika mikrotiter reader. Wszystkie próbki odczytano przeciwko antygenowi HSA jako kontrolę wiązania niespecyficznego dla F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA i B-HSA. Wyniki zostały wyrażone jako miano. Miana jest ostatnim rozcieńczeniem surowicy dającym absorbancję dwukrotnie większą niż HSA.,
badania swoistości i hamowania krzyżowego:
w celu określenia swoistości przeciwciał przeprowadzono badanie hamowania krzyżowego. Surowice dodatnie dla każdej koniugacji hapten-białko były badane po odpowiedniej inkubacji i wytrącaniu z dziesięciokrotnie zwiększającym się przyrostem hapten wiązanych HSA lub BSA jako inhibitorów, aby pokryć zakres nadmiaru przeciwciał przeciwko antygenowi. Zakres ten wynosił od 50 g do 1000 g dla hapten-BSA i 80 g do 1000 g dla hapten-RSA., Po inkubacji w temperaturze 37 ° C i usunięciu osadu przez odwirowanie próbki z badań przed i po hamowaniu krzyżowym umieszczano następnie na płytkach ze studniami pokrytymi specyficznym koniugatem. Kolejne etapy przeprowadzono w sposób opisany powyżej w badaniu ELISA.
Wiązanie przeciwciał IgG i IgM z różnymi koniugatami było hamowane przez hapten-HSA lub hapten-BSA z 36-85%. Przy danym stężeniu zarówno hapten-HSA, jak i hapten-BSA hamowały poziom przeciwciał w podobny sposób.,
częściowe hamowanie wiązania przeciwciał IgE z różnymi koniugatami haptenu obserwowano podczas wstępnej inkubacji surowicy z hapten-HSA lub hapten-BSA. Ta niepełna obserwacja hamowania przeciwciał IgE była związana głównie z brakiem dostępności surowicy o wysokim mianie IgE wobec różnych substancji chemicznych w naszym laboratorium.,
oznaczanie prawidłowego poziomu przeciwciał (kontroli):
na podstawie powyższych procedur przebadano 160 próbek krwi zdrowych osób obu płci w wieku od 22 do 55 lat pod kątem poziomu przeciwciał przeciwko F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA i B-HSA. Średnie miano wynosiło 1: 800 400 dla IgG, 1: 3200 1600 dla IgM i 1: 8 4 dla IgE. Tak więc w naszym laboratorium miana większe niż 1: 1600 dla IgG, 1: 6400 dla IgM i 1: 16 dla IgE są uważane za dodatnie.,
u danego pacjenta zwiększenie lub zmniejszenie miana przeciwciał o więcej niż jedno rozcieńczenie uznano za istotne (patrz tabele).
cytometr przepływowy pojedynczego lasera (profil Epics: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL), który rozróżnia rozpraszanie światła pod kątem prostym i prostym, a także dwa kolory, był używany z pakietem oprogramowania(Quad Stat: Coulter). Populacje komórek jednojądrzastych oznaczono dwukolorową bezpośrednią immunofluorescencją przy użyciu techniki barwienia krwi pełnej odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi i cytometrią przepływową (Fletcher et al.,, 1989) wybrano następujące pary izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub sprzężonych przeciwciał monoklonalnych fikoerytryny (PE) (immunologia Coultera): T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI i T11-FITC/Tal-PE do oznaczania limfocytów T/B, T-helper/t-supresor, NKHT3+ /nkhy3 i alternatywny szlak aktywacji limfocytów odpowiednio.
aby monitorować markery limfocytów, mapy bat zostały ustawione na populacji limfocytów rozproszenia światła pod kątem do przodu w porównaniu do histogramu rozproszenia światła 90., Określono procent dodatnio zabarwionych komórek dla każdej pary markerów, a także procent podwójnie zabarwionych komórek. Oszacowania bezwzględnej liczby limfocytów dodatniej dla odpowiednich markerów powierzchniowych wyznaczono przez pomnożenie liczby limfocytów obwodowych przez procent dodatnio zabarwionych komórek dla każdej pary markerów. Określono również procent podwójnie barwionych komórek., Oszacowania bezwzględnej liczby limfocytów dodatnich dla odpowiednich markerów powierzchniowych oznaczano przez pomnożenie liczby limfocytów obwodowych przez procent liczby komórek dodatnich dla każdego markera powierzchniowego.
pomiar przeciwciał przeciwko białkowi zasadowemu mieliny:
podstawowe białko mieliny ludzkiej (Hmbp) zostało przygotowane metodą Dieblera i in. (1972) i sprawdzone pod kątem czystości za pomocą elektroforezy z żelu poliakrylaminowego. U królików wywołano antyserum do HMBP poprzez wielokrotne wstrzyknięcie HMBP w kompletny adiuwant Freunda., Aktywność przeciwciał w surowicach króliczych i próbkach pacjentów została wykryta poprzez dodanie różnych rozcieńczeń (1:100 do 1:10 000) surowic do studzienek z mikrotitry pokrytej wcześniej HMBP w następujący sposób: HMBP 250 g/ml rozpuszczono w buforze węglanowym, PH 9,6 i 200 l tego roztworu dodano do każdej studzienki. Po inkubacji, umyciu i zablokowaniu jak wyżej, do studzienek dodano 200 1 rozcieńczonego królika lub surowicy ludzkiej. Po inkubacji przez I godzinę w temperaturze 37 ° C surowice wytrząsano ze studni, a następnie przemyto 5 razy roztworem myjącym., Do odpowiedniej studni dodano 200 1 sprzężonych peroksydazą kozy anty-królika lub kozy anty-człowieka IgG, IgM lub IgA (optymalne rozcieńczenie). Po inkubacji i wielokrotnym myciu do każdej studni dodano 200 1 substratu ABTS. Płytki inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej i odczytywano w czytniku mikrotiterowym o długości fali 405 ton. Stosując antysurowice królików; wykreślono krzywą miareczkowania i porównano surowice pacjenta z tą krzywą standardową., Na podstawie ponad 200 badań kontrolnych i oznaczeń próbek pacjentów, litry większe niż 1:2000 dla IgA, 1:5000 dla IgM i 1: 8000 dla IgG uznano za dodatnie.