wycięcie uracyl DNA z udziałem UDG i rozszczepianie chemiczne AP na mikroramieniach
rozszczepianie nici DNA za pośrednictwem UDG składa się z dwóch odrębnych etapów: wycięcie Zasady uracyl, a następnie rozszczepianie powstałej miejsce. Te dwa etapy mogą być oddzielnie monitorowane na mikromacierzach DNA., Po pierwsze, miejsca abasowe są generowane przez traktowanie tablicy z UDG, a w drugim etapie, rozszczepienie nici jest indukowane przez wystawienie oligonukleotydów DNA zawierających abasowe na kwaśne lub podstawowe warunki lub przez odparowanie powierzchni do suchości. Takie chemiczne strategie rozszczepienia miejsc abasowych na nici DNA eliminują potrzebę dodatkowego rozszczepienia enzymatycznego i pozwalają na niezależne badanie kinetyki UDG., W tym celu zaprojektowano i zsyntetyzowano tablice 30-metrowych sekwencji DNA z rosnącą liczbą nieciągłych dU-inkluzji (dU1 – dU9)za pomocą bezmaskowej fotolitografii kwasu nukleinowego, przy użyciu odpowiedniego światłoczułego fosforanu du (rys. 2). Każda nić DNA została zsyntetyzowana za pomocą łącznika dT15 do szklanej powierzchni i zakończona na końcu 5’sekwencją docelową 25mer do hybrydyzacji( QC25), jak wskazano na Rys. 3.,
Molecular structure of the 5′-NPPOC deoxyuridine 3′-phosphoramidite (in the text referred to as dU or uracil nucleotide.
(A) Sequence design for the investigation of uracil and abasic site cleavage on microarrays., Każda sekwencja składa się z DT15-linkera, następnie 30mer bez du (kontroli) lub rosnącej liczby du (od 1 do 9) zastępującej dTs w następującej sekwencji: 5′ – TTA CCA TAG AAT CAT GTG CCA Tac ATC-3′. Na końcu 5’syntetyzowany jest kontrolny 25mer (QC25), służący jako cel hybrydyzacji z oligonukleotydem uzupełniającym znakowanym 3′-Cy3 (QC25c). Proces rozszczepienia był monitorowany przez rejestrację intensywności fluorescencji opartej na hybrydyzacji przed i po rozszczepieniu nukleotydów uracylu za pośrednictwem UDG. B) mały fragment (ok., 7% całkowitej powierzchni syntezy) skanowania fluorescencyjnego przed i po ekspozycji na enzymy. Skany pokazują intensywność fluorescencji, wynikającą z hybrydyzacji z oznakowanym, komplementarnym oligonukleotydem. Mikromacierze skanowano w rozdzielczości 5 µm. C) zmniejszenie intensywności fluorescencji w wycięciu uracylu z udziałem UDG (generując w ten sposób miejsca abasowe) jako funkcja liczby włączonych nukleotydów dU na substrat DNA. Rzeczywista efektywność rozszczepienia koreluje z utratą intensywności fluorescencji wynikającą z rozszczepienia substratu DNA., Tablica była inkubowana przez jedną godzinę za pomocą UDG, a wytworzone miejsca abasowe zostały następnie rozszczepione w warunkach alkalicznych. Spadek intensywności fluorescencji został zarejestrowany i znormalizowany do pasma kontrolnego (U0). Znormalizowane intensywności, wskazane w dowolnych jednostkach, zostały wykreślone na liczbę dUs na substrat DNA. Paski błędów to SD.
lokalizacja wszystkich sekwencji sondy wraz z odpowiadającymi replikatami i pasmami kontrolnymi przenoszącymi DT zamiast nukleotydów dU została randomizowana na powierzchni mikromacierzy., Przed obróbką enzymatyczną sekwencje sondy DNA zostały hybrydyzowane do znakowanego Cy3 komplementarnego oligonukleotydu 25mer (QC25c) w celu określenia początkowych wartości intensywności fluorescencji. Oznaczenie 3 ' – Cy3 zostało użyte w celu zapobieżenia ewentualnym artefaktom fluorescencyjnym wynikającym z interakcji barwnika ze zmienną liczbą dUs46. Następnie mikromacierze poddano działaniu UDG pochodzącego z E. coli, a rozszczepienie w miejscu abasowym przeprowadzono w różnych warunkach. Optymalny czas ekspozycji na enzym wyznaczono we wstępnych eksperymentach. Nasze wyniki (rys., S1) wykazują, że po dodaniu enzymu, wydajność dekoltu wzrasta znacznie z czasem, do jednej godziny, osiągając wydajność około 50-60%, z niewielkimi zmianami po dalszej ekspozycji na UDG. W ten sposób ustawiamy optymalny czas ekspozycji na jedną godzinę. Ponadto nasze dane wyraźnie pokazują zwiększoną skuteczność dekoltu przy rosnącej liczbie dU, od 40 do 60% (figi. 3C i S1).
następnie przeszliśmy do badania rzeczywistego etapu dekoltu, czyli usunięcia miejsca abazycznego po wycięciu podstawy uracylu., Zgodnie ze znanymi strategiami chemicznie indukowanego rozszczepienia miejsca abazycznego w roztworze20,30, powstałe miejsca AP zostały następnie rozszczepione w warunkach alkalicznych przez zanurzenie tablic w roztworze etylenodiaminy (Eda)/etanolu 1:1(v/V) lub tablice zostały poddane obróbce w warunkach kwaśnych przez zanurzenie w 30% (V/V) roztworze kwasu trichlorooctowego w dichlorometanie lub przez odparowanie powierzchni tablicy do suchości. We wszystkich metodach zabiegi wykonywane były w różnych okresach czasu, od 1 do 24 godzin., Następnie tablice poddano rehybrydyzacji do oligonukleotydu uzupełniającego znakowanego Cy3 oligonukleotydem 25mer (QC25c), a uzyskane natężenia fluorescencji porównano z tymi uzyskanymi przed leczeniem UDG w celu określenia skuteczności rozszczepienia. Uzyskane szybkości dekoltu są podane na Rys. 4.
zmniejszenie natężenia fluorescencji po chemicznie wywołanym rozszczepieniu abasowym na podłożach o różnej liczbie du incorporacji i w funkcji czasu., Rzeczywista efektywność rozszczepienia koreluje z utratą intensywności fluorescencji, wynikającą z rozszczepienia substratu DNA. Spadek natężenia fluorescencji został zarejestrowany i znormalizowany do wartości pasma kontrolnego (U0). Znormalizowane natężenia, wskazane w dowolnych jednostkach, zostały wykreślone w czasie ekspozycji na zabiegi chemiczne. Matrycę DNA poddano obróbce w warunkach kwaśnych (A), zasadowych (B) lub przez odparowanie powierzchni do suchości (C) i przez różne czasy ekspozycji(1, 2, 4, 8, 12 i 20 godzin)., Pasma substratu zawierały różne proporcje nukleotydów dU oznaczone różnymi kolorami: U0( czarny), U1 (czerwony), U2 (jasnozielony), U3 (żółty), U4 (niebieski), U5 (różowy), U6 (turkusowy), U7 (szary), U8 (ciemnoczerwony) i U9 (ciemnozielony). Paski błędów to SD.
w Warunkach podstawowych (rys. 4B), rozszczepienie obszarów AP wymaga minimum 2 godzin inkubacji w celu zaobserwowania znacznego rozszczepienia (40 do 60%) substratów. Jednak obróbka tablicy kwasem lub suszenie jej powierzchni (rys., 4A,c, odpowiednio) powoduje wyraźne i rozległe rozcięcie po zaledwie jednej godzinie (30 do prawie 80% W przypadku leczenia kwaśnego), gdy dekolt w miejscu abasowym, za pośrednictwem EDA, jest minimalny po jednej godzinie. Jest prawdopodobne, że sama reakcja rozszczepienia w metodach A i C jest promowana na końcowym etapie hybrydyzacji, ze względu na temperaturę lub obecność aminy w buforze., Niemniej jednak, ponieważ hybrydyzacja jest wspólna dla wszystkich trzech metod, duże różnice w kinetyce dekoltu między podstawowymi i nie-podstawowymi metodami leczenia wskazują na możliwość, że dodatkowe miejsca AP mogą być wytwarzane w obecności kwasu lub pod zmniejszonym ciśnieniem, dając dodatkowe pozycje na nici DNA, przy których może wystąpić następująca reakcja dekoltu. Dłuższe zabiegi, niezależnie od metody, nie zmieniają znacząco rozmiaru dekoltu, Zwykle zbliżając się do 40% do 80% w zależności od liczby duracji., Rzeczywiście, widzimy wyraźny ogólny wzrost wydajności dekoltu przy coraz większej liczbie podwójnych połączeń, we wszystkich testowanych warunkach.
oprócz przeprowadzania chemicznie indukowanego rozszczepiania nici DNA w miejscach abazycznych, zbadano jakość powierzchni mikromacierzy. W tym celu wizualnie skontrolowano jednorodność cech na powierzchniach tablicy na podstawie intensywności fluorescencji i monitorowano utratę fluorescencji dla nietłukących się pasm kontrolnych., Odkryliśmy, że rozszczepienie w miejscu abasowym w warunkach alkalicznych pozwoliło na specyficzne, enzymatyczne rozszczepienie sekwencji zawierających dU, ale pozostawiło sekwencje kontrolne praktycznie nietknięte, podczas gdy w warunkach kwaśnych, rozszczepienie nici DNA zaobserwowano również dla nici kontrolnych pozbawionych nukleotydów uracylu (rys. S2). Suszenie powierzchni doprowadziło również do degradacji pasm kontrolnych dT-only. Ponieważ tylko rozszczepienie miejsca abasowego w warunkach alkalicznych pozwala uniknąć degradacji powierzchni i niespecyficznej utraty DNA, przeprowadziliśmy wszystkie kolejne eksperymenty w tych warunkach., Gwarantuje to, że nieusuwalne sekwencje kontrolne pozostają dostępne do porównania nawet po długiej obróbce chemicznej.
jedno – i dwuniciowa zależność sekwencji UDG
ponieważ nasze wyniki dotyczące rozszczepiania dU za pośrednictwem E. coli dostarczyły tylko umiarkowanych wydajności rozszczepiania nici DNA zawierających pojedyncze połączenia dU (≈40%), zbadaliśmy specyficzność sekwencyjną UDG w celu potencjalnie zidentyfikowania silnie rozszczepionego substratu zawierającego dU. W tym celu zaprojektowaliśmy bibliotekę kwasów nukleinowych zawierających dU z dwu-i jednoniciowych sekwencji DNA., Biblioteka składa się z sekwencji 7mer permutable z pojedynczym dU w środku (rys. 5). Permutacja 3 – nt, 5′ – oraz 3 ' dU daje 4096 unikalnych sekwencji. W formacie dwuniciowym dodano pętlę i sekwencję komplementarną do 7mer, co doprowadziło do powstania struktury spinki do włosów. Dodatkowe pary zasad dG * dC w łodydze Spinka pomógł w zwiększeniu temperatury topnienia struktury DNA Spinka. Te pary bazowe zostały dodane do jednoniciowych substratów w celu utrzymania konstrukcji ssDNA i dsDNA jak najbardziej zbliżonych., Ostatecznie, 25mer oligonucleotide został dodany do 5 ' – końca każdego projektu, aby służyć jako cel hybrydyzacji. Reprezentatywna postać wzorów sekwencji pokazana jest na Rys. 5.
schematyczna ilustracja projektu sekwencji do badania sekwencji UDG E. coli zależy od jedno- (a) i dwuniciowych substratów DNA., B) w celu zbadania zależności sekwencji UDG, pojedynczy dU jest wbudowany w pasmo DNA i zamknięty przez 3 permutowane zasady po każdej stronie. A projekt badania zależności sekwencji UDG od jednoniciowych substratów DNA składa się z 15mer dT-linkera, pojedynczego dU zamkniętego 3 permutowanymi zasadami po każdej stronie, a następnie sekwencji 5′ 25MER (QC25) służącej jako cel dla hybrydyzacji z oligonukleotydem uzupełniającym znakowanym 3′-Cy3 (QC25c). B w badaniu zależności sekwencji UDG od dwuniciowych substratów DNA, sekwencje zostały zaprojektowane w celu utworzenia pętli spinki do włosów., Powstałe pasma składały się z 15mer DT-linker, 11-nt łodygi, równoważnej konstrukcji jednoniciowej, zawierającej zmienny region otoczony parami bazowymi dG·dC, pętli 4-nt, a następnie komplementarnej nici 11nt. Na końcu 5′ zsyntetyzowano hybrydyzowalną sekwencję celu 25MER (QC25).,
chociaż końcowe etykietowanie DNA za pomocą barwnika fluorescencyjnego jest wygodną metodą bezpośredniego pomiaru natężenia fluorescencji, niesie ze sobą wadę szumu fluorescencyjnego, który, szczególnie w przypadku mikromacierzy o dużej gęstości, utrudnia ekstrakcję i interpretację danych. Dlatego zdecydowaliśmy się monitorować reakcję dekoltu poprzez hybrydyzację z unieruchomionymi sekwencjami., Przed leczeniem UDG, jedno-i dwuniciowe substraty DNA zostały hybrydyzowane z znakowanym oligonukleotydem 25mer uzupełniającym i skanowane w celu uzyskania początkowych wartości fluorescencji. Następnie mikromacierze były narażone na UDG przez różne okresy czasu. Po kolejnym rozszczepieniu AP w warunkach alkalicznych, tablice zostały ponownie hybrydyzowane z ich uzupełnieniami znakowanymi Cy3. Spadek sygnału fluorescencji nici DNA w stosunku do wartości fluorescencji przed obróbką odpowiada bezpośrednio wydajności rozszczepienia., Maksymalna wydajność rozszczepiania wynosiła około 40% W przypadku substratów dwuniciowych po inkubacji UDG przez 2 minuty oraz nieco niższe wskaźniki rozszczepiania w przypadku substratów jednoniciowych (tabela S1). Ta niższa stawka dla jednoniciowych przeczy wcześniejszym badaniom wskazującym,że są one rozcinane szybciej niż ich dwuniciowe odpowiedniki13,47, 48. Co ciekawe, bardzo krótkie inkubacje enzymatyczne (<1 min) nadal prowadzą do znacznej wydajności dekoltu (30-35%)., Te krótkie punkty czasowe są szczególnie interesujące, ponieważ dają wyraźne wskazówki dotyczące potencjalnych preferencji sekwencji. W celu określenia zależności sekwencji w degradacji DNA pośredniczącej w UDG z naszego zestawu 4096 pojedynczych nici, skupiliśmy się na 1% (rys. 6) oraz 5% (rys. S3) z najbardziej i najmniej rozszczepionego podzbioru sekwencji. Reprezentatywne motywy sekwencji generowane z tych podzbiorów sekwencji pokazano na Rys. 6 oraz w informacjach uzupełniających.,
reprezentatywne motywy sekwencji rozszczepienia uracylu za pośrednictwem UDG na dwuniciowych (A,B) i jednoniciowych (C,D) pasmach DNA. Substraty inkubowano z UDG przez różne okresy czasu, od 5 sekund do 30 minut (ponieważ motywy dekoltu wykazywały niewielką zależność sekwencyjną lub nie, tylko 5s, 30s, 60s i 120s oznaczono dla ssDNA)., Motywy sekwencyjne zostały wyodrębnione z 1% (41 Z 4096 sekwencji) sekwencji najbardziej rozszczepionych (A,C) i najmniej rozszczepionych (B,D) w bibliotece.
dla dwuniciowego DNA (rys. 6A, B), wyniki pokazują wyraźną preferencję sekwencji UDG dla regionów bogatych w G / C otaczających uracyl. I odwrotnie, UDG wydaje się słabo przetwarzać dwuniciowe podłoża zawierające pary zasad T * A. Motywy wydobywane z lepszych i uboższych podłoży UDG są częściowo zgodne z bardzo ograniczoną istniejącą literaturą data48, 49, 50. Seibert et al., postawiono hipotezę, że skuteczność UDG E. coli jest związana z kosztem energetycznym zginania DNA i zniekształceń występujących w procesie rozpoznawania specyficznych uszkodzeń. W symulacji dynamiki molekularnej i eksperymentach fluorescencyjnych z dwiema dwuniciowymi sekwencjami DNA zawierającymi uracyl zidentyfikowano, że skuteczne stałe siły zginania są niższe, jeśli dAs lub dTs sąsiadują z nukleotydem uracylu, zamiast dGs i dCs; sugerując, że sekwencje bogate w dA/dT mogą być łatwiej gięte przez UDG, a tym samym lepiej przetwarzane49., Ponieważ jednoniciowe DNA jest znacznie bardziej elastyczną formą DNA, jego szybsze przetwarzanie opisane w literaturze może być spowodowane niższym kosztem energetycznym rozszczepiania substratów, które są z natury bardziej elastyczne niż dsDNA7, 47,49, 51. Zginanie może jednak nie być decydującym czynnikiem w specyficzności UDG dla ssDNA, przy czym enzym rozpoznaje i rozszczepia wszystkie substraty równie dobrze, co może wyjaśniać brak konsensusu sekwencji w ssdna zawierającym dU., Mimo to postawiono hipotezę, że efekty kontekstu sekwencji nadal rozciągają się na jednoniciowe DNA i rzeczywiście obserwowano UDG z wirusa opryszczki zwykłej typu 152, ale nadal pozostaje niejasne dla UDG ludzkiego lub E. coli. Slupphaug et al. zmierzył specyficzność sekwencyjną ludzkiego UDG w 34 kontekstach sekwencji dsDNA i przypuszczał, że dT 3 ' do dU zawsze powoduje powolne usuwanie, podobnie jak, nieco niezgodnie, wysoka zawartość GC50. Eftedal et al. oceniono skuteczność rozszczepienia zarówno grasicy cielęcej, jak i UDG E. coli z 41 sekwencji dsDNA i znaleziono podobny wzór., Dzięki naszemu znacznie większemu zestawowi sekwencji możemy zgodzić się, że dT 3′ do dU zawsze powoduje powolne usuwanie, ale nasze dane wyraźnie pokazują, że dC, a w mniejszym stopniu dG, 3′ do dU powoduje szybkie usuwanie. Nie byliśmy w stanie zidentyfikować znaczącej zależności sekwencji dla wycięcia dU na ssDNA (rys. 6C, D). Należy zauważyć, że zależność sekwencji w substratach dsDNA jest jasna dla krótkich zabiegów enzymatycznych (5s, 30s, 60s i 120s), ale powoli zanika dla dłuższej ekspozycji UDG( 30min), co wskazuje, że wszystkie substraty są ostatecznie rozszczepiane po wystawieniu na działanie enzymu.,
Optymalizacja miejsca rozszczepienia
ponieważ w naszych badaniach nie stwierdzono znaczącej zależności sekwencji dla wycięć uracylu pośredniczącego w UDG na jednoniciowym DNA i uzyskano raczej umiarkowaną wydajność rozszczepienia dla pojedynczych inkorporacji dU, zdecydowaliśmy się zbadać wycięcie du za pośrednictwem UDG na dłuższych substratach jednoniciowych zawierających różne formy wielokrotnych inkorporacji dU, mając na celu identyfikację konkretnych miejsc rozszczepienia, które są łatwo dostępne enzymatycznie i pozwalają na szybkie i wydajne rozszczepienie nici., Naszym uzasadnieniem jest to, że zwiększenie odległości sondy od powierzchni powinno zapewnić większą dostępność dla rozszczepienia, ale efekt ten nie może przenosić się na długie dystanse (>20-nt) 53. Na podstawie wyników z Rys. 3, spodziewamy się również większej liczby du, która doprowadzi do większego całkowitego rozszczepienia, ale zastanawiamy się, czy istnieje optymalna gęstość nukleotydów dU w rozszczepialnym odcinku nici DNA. Dlatego badaliśmy rozszczepienie uracylu na dłuższych homopolimerach dU (10, 15 i 20m), a także na oligomerach o zróżnicowanym %składzie dU., Procent dU w oligomerze został obliczony w stosunku do pozostałych czterech nukleotydów (dA, dC, dG I dT) i doświadczalnie osiągnięty przez przeprowadzenie reakcji sprzęgania z wstępnie wymieszanymi roztworami fosforanów du/dA/dC/dG / dT w różnych proporcjach (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 lub 100: 0, (v/v) dU: dA / dC / dG / dT). Sekwencje, zbudowane na łącznikach poly-dT o różnych długościach (dT1, dT5, dT10 i dT15) i regionie zawierającym dU zostały następnie zakończone sekwencją docelową 25mer dla celów hybrydyzacji, jak wskazano na Rys. 7.,
skuteczność rozszczepienia jednoniciowych substratów z UDG lub enzymami użytkownika. Badane są trzy parametry: długość łącznika (w Kolorze Niebieskim), długość segmentu zawierającego dU (odpowiednio 10, 15 lub 20 nt w kolorze czarnym, szarym i jasnoszarym) oraz zawartość dU (od 0 do 100%, na osi x). Wszystkie substraty są zakończone na końcu 5ʹ z sekwencją hybrydyzowalną 25mer., Odpowiednie mikrocząsteczki poddano działaniu UDG lub enzymu użytkownika (5 U, 1 h w temperaturze 37 °C), a następnie, w przypadku leczenia UDG, Eda/EtOH przez 2 h W RT.skuteczność rozszczepienia odpowiada utracie fluorescencji hybrydyzacji po leczeniu enzymatycznym i w stosunku do 0% grupy kontrolnej dU.
po syntezie 25mer został hybrydyzowany z komplementarnym oligonukleotydem znakowanym 5′-Cy3, a mikroarray był narażony na UDG przez 1 godzinę., Następnie w warunkach alkalicznych przeprowadzono rozszczepienie miejsca abasowego, po czym przeprowadzono ostateczną rehybrydyzację. Równolegle wykonaliśmy również test dekoltu za pomocą enzymu użytkownika, co w tym przypadku eliminuje potrzebę dodatkowej procedury dekoltu w miejscu abasowym.
dla oznaczenia enzymu UDG, a następnie rozszczepienia w miejscu abasowym w warunkach alkalicznych (rys. 7, po lewej), odnotowaliśmy skuteczność dekoltu w zakresie od 4% do 80% i pojawiły się wyraźne trendy., Na przykład wydajność dekoltu znacznie wzrasta wraz ze wzrostem długości regionu zawierającego dU, w kolejności 10mer > 15mer > 20mer, z maksymalnym ~50% rozcięciem osiągalnym dla regionu 10mer dU i maksymalnie 80% dla regionu 20mer dU. Podobnie, dłuższe łączniki skutkują ogólnym wyższym odsetkiem dekoltu. Obserwacje te wskazują, że dłuższe sekwencje są lepiej rozpoznawane, a odpowiednie zasady uracylu są lepiej usuwane przez UDG, co z kolei sugeruje większą dostępność dłuższych substratów przez enzym., Na efektywność rozszczepiania wpływa również ilość nukleotydów dU w rozszczepialnej części substratu. Rzeczywiście, homopolimery uracylu (100% dU) są prawie zawsze mniej rozszczepione niż ich kongenery z przeplatanymi nukleotydami dU, a efekt ten jest szczególnie wyraźny, gdy substraty są syntetyzowane przez krótki łącznik T1. Z drugiej strony zwiększenie zawartości dU z 12 do 50% spotyka się ze zwiększeniem wydajności dekoltu, przy czym 50% dU wydaje się być optymalną ilością., Tak więc, w naszych warunkach doświadczalnych, rozszczepienie za pośrednictwem UDG było najbardziej efektywne na najdłuższych substratach, gdzie połowa nukleotydów w rozszczepialnej części to dU(80% skuteczność rozszczepiania). Ten trend, jak również dane pokazane na Rys. 3, sugeruje, że UDG może rozpoznawać i wiązać wiele dU, o ile dUs są oddzielone kanonicznymi nukleotydami DNA.
podczas gdy krótkie homopolimery są ogólnie znane jako słabe substraty UDG, spodziewamy się również zaobserwować niskie tempo rozszczepienia dla 20mer rozszczepialnych regionów, ponieważ takie substraty są mało prawdopodobne, aby znaleźć w DNA., W warunkach in vivo Zasady uracylu występują głównie w pasmach DNA z powodu błędnej korelacji podczas replikacji lub z powodu deaminacji8, 9 i jest mało prawdopodobne, aby oba procesy występowały z tak wysoką częstotliwością, tworząc homopolimery. Niemniej jednak, umiarkowane do wysokiej wydajności dekoltu około 60% na długo 20mer homopolimery dU uzyskano, ale czy te homopolimery są przetwarzane wolniej niż substratów o niższej zawartości dU % pozostaje do zbadania.
, 7, po prawej) prowadzi do zadowalającego rozszczepienia jednoniciowych substratów, z tendencjami rozszczepienia nieco porównywalnymi do przypadku UDG, ale z kilkoma znaczącymi wyjątkami. Po pierwsze, najwyższa skuteczność rozszczepienia jest niższa niż w przypadku systemu UDG / EDA (odpowiednio 55% w porównaniu z 80%), co może być przypisane wolniejszemu przetwarzaniu miejsc abasowych endonukleazy VIII w porównaniu z powszechnym leczeniem podstawowym EDA., Po drugie, wydaje się, że w regionie rozszczepialnym występuje słabsza dyskryminacja długości w porównaniu z regionami UDG/EDA, z najwyżej 20-25% różnicą między regionami krótkimi (10-nt) i długimi (20-nt) zawierającymi du, gdy tylko leczenie UDG doprowadziło do dużych różnic w skuteczności rozszczepiania tych samych 10 i 20 Mers (różnica do 50%). Ponownie, efekt ten może być spowodowany różnicami w szybkości przetwarzania witryn AP. Wreszcie homopolimery dU wydają się być degradowane w takim samym stopniu, niezależnie od długości łącznika lub substratu., Ten brak dyskryminacji w przypadku enzymu użytkownika i w porównaniu z danymi o rozszczepieniu za pośrednictwem UDG sugeruje, że istnienie wielu, następujących po sobie miejsc AP jest czynnikiem ograniczającym enzymatyczne usuwanie miejsc AP.
podsumowując, w naszych rękach odkryliśmy, że najlepszą wydajność dekoltu można osiągnąć za pomocą dekoltu UDG, a następnie leczenia EDA na dłuższych, nie homopolimerycznych substratach zawierających uracyl. W ten sposób sekwencje jednoniciowe zawierające 50% dU mogą być skutecznie rozcinane, aczkolwiek w dwóch etapach., Krótki, jednoetapowy zabieg za pomocą koktajlu enzymatycznego użytkownika może również wygodnie rozszczepić do 50% pojedynczych nici zawierających dU w ciągu jednej godziny, jednak pozornie niższa moc rozróżniająca tego konkretnego leczenia enzymatycznego może być mniej przydatna, gdy wymagane jest preferencyjne rozcięcie.