a Especificidade e Eficiência do Uracilo-DNA Glicosilase Mediada Vertente Clivagem Pesquisados em Grande Sequência de Bibliotecas

UDG-mediada uracilo excisão e química AP sítio de clivagem em microarrays

DNA clivagem mediada por UDG consiste em duas etapas distintas: a excisão de base uracilo seguido de clivagem da resultante local abásico site. Os dois passos podem ser monitorados separadamente em microarray de DNA., Em primeiro lugar, os locais abásicos são gerados pelo tratamento da matriz com UDG e, em um segundo passo, a clivagem da cadeia é induzida pela exposição dos oligonucleótidos de superfície amarrados, DNA contendo locais abásicos a condições ácidas ou básicas, ou pela evaporação da superfície à secura. Tais estratégias químicas para clivagem de locais abásicos em cadeias de ADN eliminam a necessidade de clivagem enzimática adicional e permitem que a cinética UDG seja estudada independentemente., Para este efeito, matrizes de sequências de ADN de 30mer com um número crescente de Du-incorporações não consecutivas (dU1 – dU9) foram concebidas e sintetizadas por fotolitografia de ácido nucleico sem máscara, utilizando a fotossensível dU fosforamidite (Fig. 2). Cada cadeia de ADN foi sintetizada com uma linha dT15 para a superfície de vidro e terminada na extremidade 5’com uma sequência alvo de 25mer para hibridação (QC25), como indicado na Fig. 3.,

a localização de todas as sequências de sonda, juntamente com as correspondentes réplicas e cadeias de controlo que transportam dT em vez de Du nucleótidos, foi Aleatória na superfície de microarray., Antes do processamento enzimático, as sequências de sonda de ADN foram hibridizadas com o oligonucleótido complementar 25mer (QC25c) marcado com Cy3, a fim de determinar os valores iniciais de intensidade de fluorescência. 3 ‘ – Cy3 etiquetagem foi usada para prevenir possíveis artefatos de fluorescência devido a interações do corante com o número variável de dUs46. Os microarrays foram então expostos a UDG comercialmente proveniente de E. coli e a clivagem do local abásico foi subsequentemente realizada em várias condições. O tempo de exposição enzimática Ideal foi determinado em experiências iniciais. Os nossos resultados (Fig., S1) mostrar que, após a adição da enzima, a eficiência de clivagem aumenta significativamente com o tempo, até uma hora, atingindo uma eficiência de cerca de 50-60%, com apenas ligeiras alterações após uma exposição adicional à UDG. Assim, fixamos o tempo de exposição ideal para uma hora. Além disso, os nossos dados mostram claramente uma maior eficiência de clivagem com um número crescente de dU, de 40 a 60% (figos. 3C e S1).

então seguimos para estudar o passo de clivagem real, a remoção do local abásico após a excisão da base de uracil., Seguinte estratégias conhecidas para quimicamente induzida por local abásico site clivagem em solution20,30, o resultado da AP-sites, em seguida, foram clivados ou em meio alcalino por imersão a matrizes em um 1:1 (v/v) solução de etilenodiamina(EDA)/etanol, ou as matrizes foram tratadas sob condições ácidas por imersão em 30% (v/v) solução de trichloroacetic acid em diclorometano, ou por evaporação da superfície da matriz para o ressecamento. Em todos os métodos, os tratamentos foram realizados para diferentes períodos de tempo, variando de 1 a 24 horas., Subsequentemente, os arrays foram rehibridizados para o oligonucleótido complementar 25mer (QC25c) marcado com Cy3 e as intensidades de fluorescência resultantes foram comparadas com as obtidas antes do tratamento com UDG, a fim de determinar a eficiência de clivagem. As taxas de clivagem resultantes estão indicadas na Fig. 4.

em condições básicas (Fig. 4B), a clivagem dos locais da AP requer um período mínimo de incubação de 2 horas, a fim de observar uma clivagem significativa (40 a 60%) dos substratos. No entanto, tratar a matriz com um ácido ou secar a sua superfície (Fig., 4A, C, respectivamente) resulta em clivagem clara e extensa após apenas uma hora (30 a quase 80% com um tratamento ácido), quando a clivagem do local abásico mediada por EDA é mínima após uma hora. É provável que a reação de clivagem em si nos métodos A E C seja promovida na fase final de hibridação, seja devido à temperatura ou à presença de uma amina no buffer., No entanto, desde a hibridação é comum a todos os três métodos, as grandes diferenças na cinética de clivagem entre básicos e não-básicos tratamentos sugere a possibilidade de que os adicionais AP sites podem ser produzidos em presença de um ácido, ou sob pressão reduzida, produzindo posições adicionais sobre o DNA vertentes em que uma clivagem reação pode ocorrer. Tratamentos mais longos, independentemente do método, não alteram significativamente a extensão da clivagem, geralmente aproximando-se de 40% a 80%, dependendo do número de incorporações de dU., Com efeito, assistimos a um claro aumento global da eficiência da clivagem, com um número crescente de incorporações duplas, em todas as condições testadas.para além da clivagem da cadeia de ADN induzida quimicamente em locais abásicos, foi examinada a qualidade da superfície de microarray. Para este efeito, foi inspeccionada visualmente a uniformidade das características das superfícies do conjunto, com base nas intensidades de fluorescência, e monitorizada a perda de fluorescência das cadeias de controlo não cliváveis., Descobrimos que a clivagem do local abásico em condições alcalinas permitia uma clivagem específica, mediada por enzimas, de sequências que continham dU, mas deixava as sequências de controlo praticamente intocadas, enquanto em condições ácidas, a clivagem da cadeia de ADN também era observada para as cadeias de controlo que não tinham nucleótidos uracil (Fig. S2). A secagem da superfície também levou à degradação das cadeias de controlo unicamente dT. Uma vez que apenas a clivagem do local abásico em condições alcalinas evita a degradação da superfície e a perda não específica de ADN, realizámos todos os experimentos subsequentes nestas condições., Isto garante que as sequências de controlo não cliváveis permanecem disponíveis para comparação, mesmo após um longo tratamento químico.uma vez que os nossos resultados sobre a clivagem du mediada por E. coli forneceram apenas eficiências de clivagem moderadas para cadeias de ADN contendo incorporação única de dU (≈40%), interrogámos a especificidade de sequência de UDG a fim de identificar potencialmente um substrato altamente clivado contendo du. Para este propósito, nós projetamos uma biblioteca de ácidos nucleicos contendo dU a partir de sequências de DNA de cadeia dupla e única., A biblioteca consiste de uma sequência permutável de 7mer com um único dU no meio (Fig. 5). A permutação das regiões flanqueadas de 3 nt, 5′ – bem como 3′ do dU resulta em 4096 sequências únicas. No formato Double-stranded, um loop e a sequência complementar para o 7mer foram adicionados, levando à formação de uma estrutura de gancho de cabelo. Os pares de base adicionais da dG * dC no caule do gancho ajudaram a aumentar a temperatura de fusão da estrutura do ADN do gancho. Estes pares de bases foram adicionados aos substratos de cadeia única, a fim de manter os projetos ssDNA e dsDNA tão similares quanto possível., Finalmente, um oligonucleótido de 25mer foi adicionado ao fim de 5’de cada projeto, a fim de servir como um alvo de hibridação. Uma figura representativa dos desenhos da sequência é mostrada na Fig. 5.

Embora o terminal de rotulagem de DNA com um corante fluorescente é um método conveniente para medir diretamente a intensidade de fluorescência, ele carrega a desvantagem de alta fluorescência de ruído que, especialmente na alta densidade de microarrays, faz a extração de dados e de interpretação mais difícil. Portanto, decidimos monitorar a reação de clivagem através da hibridação às sequências imobilizadas., Antes do tratamento com UDG, os substratos de DNA de cadeia simples e dupla foram hibridizados com o rotulado oligonucleótido complementar 25mer e digitalizados para obter valores iniciais de fluorescência. Em seguida, os microarrays foram expostos a UDG por diferentes períodos de tempo. Após a seguinte clivagem no local AP sob condições alcalinas, os arrays foram novamente hibridizados para seus complementos marcados com Cy3. A diminuição do sinal de fluorescência das cadeias de ADN em relação aos valores de fluorescência pré-tratamento corresponde directamente à eficiência de clivagem., Foram obtidas eficiências máximas de clivagem de cerca de 40% para substratos de cadeia dupla após incubação da UDG durante 2 minutos e taxas de clivagem ligeiramente inferiores para substratos de cadeia simples (quadro S1). Esta taxa mais baixa para a cadeia simples contradiz estudos anteriores que indicam que são clivados mais rapidamente do que os seus equivalentes13,47,48. Curiosamente, incubações enzimáticas muito curtas (<1 min) ainda levam a eficiências significativas de clivagem (30-35%)., Estes pequenos pontos de tempo são especialmente interessantes, Uma vez que dão dicas claras de preferências de sequência potencial. Para identificar a dependência da sequência na degradação do ADN mediada pela UDG a partir do nosso conjunto de 4096 cadeias individuais, concentrámo-nos no 1% (Fig. 6) bem como 5% (Fig. S3) do subconjunto mais e menos clivado de sequências. Os motivos de sequência representativos gerados a partir desses subconjuntos de sequência são apresentados na Fig. 6 e nas informações suplementares.,

para ADN de cadeia dupla (Fig. 6A, B), os resultados mostram uma clara preferência de sequência UDG para regiões ricas em G/C flanqueando uracil. Inversamente, UDG parece mal processar substratos de cadeia dupla contendo T * A pares de base. Os motivos extraídos de substratos UDG melhores e mais pobres estão em conformidade parcial com os muito limitados dados existentes na literatura 48,49,50. Seibert et al., a hipótese de que a eficiência da E. coli UDG está relacionada com o custo energético da flexão do DNA e distorção ocorrendo no processo de reconhecimento de danos específicos. Em simulações de dinâmica molecular e tempo de fluorescência resolvida experimentos com dois uracilo-contendo double-stranded de seqüências de DNA, eles identificaram que a efetiva força de flexão constantes são menores se dAs ou dTs está localizado ao lado do uracilo de nucleotídeos, em vez de dGs e dCs; sugerindo que dA/dT-rico sequências podem ser mais facilmente dobrado por UDG e, assim, melhor processed49., Uma vez que single-stranded DNA é muito mais flexível forma de DNA, o seu processamento mais rápido relatados na literatura, pode ser devido ao menor custo energético de clivagem de substratos que são inerentemente mais flexíveis do que dsDNA7,47,49,51. A flexão pode não ser, no entanto, um fator decisivo na clivagem UDG especificidade de ssDNA, com a enzima reconhecendo e clivando todos os substratos igualmente bem, o que talvez explique a ausência de consenso de sequência em dU-contendo ssDNA., No entanto, foi colocada a hipótese de que os efeitos de contexto de sequência ainda se estendem ao ADN de cadeia simples, e de facto tinham sido observados para a UDG do vírus herpes simplex tipo 152, mas ainda não é claro para a UDG humana ou E. coli. Slupphaug et al. mediu a especificidade da sequência de UDG humana em 34 contextos de sequência dsDNA e concluiu-se que dT 3′ to dU sempre resulta em remoção lenta como fez, de forma um pouco discordante, um elevado teor de GC50. Eftedal et al. avaliou a eficiência de clivagem tanto do timo do bezerro quanto do UDG de E. coli de 41 sequências dsDNA e encontrou um padrão semelhante., Com o nosso vasto conjunto de sequências, podemos concordar que o dT 3′ para dU resulta sempre em remoção lenta, mas os nossos dados mostram claramente que a dC, e a dG em menor medida, 3′ Para dU resulta em remoção rápida. Não fomos capazes de identificar uma dependência significativa de sequência para Du Excisão em ssDNA (Fig. 6C, D). Note-se que a dependência de sequência em substratos dsDNA é clara para tratamentos enzimáticos curtos (5s, 30s, 60s e 120), mas lentamente desaparece para uma maior exposição UDG (30min), indicando que todos os substratos são eventualmente clivados quando expostos à enzima.,

Clivagem site otimizações

Desde significativas sequência de dependência para o UDG-mediada uracilo excisão em single-stranded DNA surgiu a partir de nossos estudos e, ao invés de moderada clivagem eficiência para o único dU incorporações foram obtidos, optou-se por estudar UDG-mediada dU excisão em mais single-stranded substratos contendo várias formas de vários dU incorporações, visando a identificação de clivagem sites que são facilmente carboximetilcelulose acessível e permite uma rápida e eficiente vertente de clivagem., Nosso raciocínio é que o aumento da distância da sonda da superfície deve proporcionar maior acessibilidade para clivagem, mas este efeito não pode levar para espaçadores longos (>20-nt)53. Com base nos resultados da Fig. 3, também esperamos que um maior número de incorporações de dU leve a uma maior clivagem geral, mas nos perguntamos se há uma densidade ideal de nucleótidos dU dentro da seção clivável da cadeia de DNA. Portanto, investigamos a clivagem uracil em homopolímeros mais longos (10, 15 e 20mers), bem como em oligômeros com composição variável em dU., A percentagem de dU no oligómero foi calculado em relação aos outros quatro nucleotídeos (dA, dC, dG e dT) e experimentalmente obtidos através da realização de reações de acoplamento com pré-mistura de soluções de dU/dA/dC/dG/dT phosphoramidites em vários rácios de (0:100, 12:88, 25:75, 50:50 ou 100:0, (v/v) dU:dA/dC/dG/dT). As sequências, construídas sobre linkers de poli-dT de diferentes comprimentos (dT1, dT5, dT10 e dT15), e a região que contém o dU foram então terminadas com uma sequência-alvo de 25mer para fins de hibridação, como indicado na Fig. 7.,

Após a síntese, o 25mer foi hibridizados complementares 5′-Cy3 rotulados oligonucleotide e o microarray foi exposto a UDG por 1 hora., Em seguida, a clivagem do local abásico foi realizada sob condições alcalinas, seguido por uma rehibridização final. Em paralelo, também realizamos o ensaio de clivagem com a enzima utilizadora, o que neste caso elimina a necessidade de um procedimento adicional de clivagem do local abásico.

para o doseamento enzimático com UDG seguido de clivagem no local abásico em condições alcalinas(Fig. 7, à esquerda), registamos eficiências de clivagem variando de 4% até 80% e com tendências claras emergindo., Por exemplo, a clivagem que a eficiência aumenta significativamente com o aumento da duração do dU-contém região, na ordem 10mer > 15mer > 20mer, com um máximo de ~50% de clivagem acessível para um 10mer dU região, e máxima de 80% para o 20mer dU região. Do mesmo modo, os linkers mais longos resultam numa taxa de clivagem global mais elevada. Estas observações indicam que sequências mais longas são melhor reconhecidas e que as bases uracil correspondentes são melhor excisadas pela UDG, o que, por sua vez, sugere uma maior acessibilidade dos substratos mais longos pela enzima., A eficiência de clivagem também é afetada pela quantidade de nucleótidos dU dentro da parte clivável do substrato. Na verdade, homopolímeros de uracilo (100% dU) são quase sempre menos clivados do que os seus congéneres com nucleótidos intercalados, e este efeito é particularmente claro quando os substratos são sintetizados sobre um linker T1 curto. Por outro lado, aumentar o teor de dU de 12 para 50% é alcançado com uma eficiência crescente de clivagem, com 50% dU parecendo ser a quantidade ideal., Assim, sob nossas condições experimentais, a clivagem mediada pela UDG foi a mais eficiente nos substratos mais longos onde metade dos nucleótidos na parte clivável são dU (eficiência de clivagem de 80%). Esta tendência, bem como os dados apresentados na Fig. 3, sugges that UDG can recognize and bind to multiple dU incorporations, as long as dUs are separated by canonical DNA nucleotides.

embora os homopolímeros curtos sejam geralmente conhecidos por serem substratos de UDG pobres, também esperávamos observar baixas taxas de clivagem para as regiões com 20mer clivable, uma vez que tais substratos são improváveis de serem encontrados no DNA., In vivo, as bases uracil ocorrem principalmente em cadeias de ADN devido à misincorporação durante a replicação ou devido à deaminação8,9 e ambos os processos são improváveis de ocorrer com uma frequência tão elevada para formar homopolímeros. No entanto, foram obtidas eficiências de clivagem moderadas a elevadas de cerca de 60% em homopolímeros de 20 mm de comprimento, mas continua por investigar se esses homopolímeros são processados mais lentamente do que substratos com um teor de dU inferior a%.

tratar uma biblioteca de matriz de ADN semelhante com o sistema enzimático do utilizador (Fig., 7, direita) conduz a uma clivagem satisfatória de substratos de cadeia única, com tendências de clivagem um pouco comparáveis ao caso UDG, mas com algumas exceções notáveis. Em primeiro lugar, a maior eficiência de clivagem é inferior à do sistema UDG/EDA (55% versus 80%, respectivamente), o que pode ser atribuído a um processamento mais lento dos locais abásicos com Endonuclease VIII em comparação com um tratamento básico comum com EDA., Em segundo lugar, parece haver uma discriminação de comprimento mais fraco na região com clivagem em comparação com UDG/EDA, com apenas 20-25% de diferença no máximo entre regiões curtas (10-nt) e longas (20-nt) du-containing, quando o tratamento UDG sozinho levou a grandes variações na eficiência de clivagem dos mesmos 10 e 20mers (até 50% de diferença). Mais uma vez, este efeito pode ser devido a diferenças na taxa de processamento de sites da AP. Finalmente, os homopolímeros dU parecem ser degradados na mesma extensão, independentemente do comprimento do linker ou do substrato., Esta falta de discriminação no caso das enzimas utilizadoras e em comparação com os dados de clivagem mediados pela UDG sugere que a existência de múltiplos locais de AP consecutivos é o fator limitante na remoção enzimática dos locais de AP.

para resumir, em nossas mãos, descobrimos que as melhores eficiências de clivagem podem ser conseguidas com a clivagem mediada pela UDG seguida pelo tratamento EDA em substratos de uracil mais longos, não homopoliméricos. Ao fazê-lo, sequências de cadeia simples contendo 50% de dU podem ser eficientemente clivadas, embora em duas etapas., Um tratamento curto e único com o coquetel enzimático do Utilizador também pode, convenientemente, clivear até 50% de fios simples contendo dU numa hora, no entanto, o poder de discriminação aparentemente mais baixo deste tratamento enzimático em particular pode ser menos útil quando é necessária uma clivagem preferencial.