SDS-PAGE (sódico dodecilsulfato-poliacrilamida gel electroforese) é habitualmente utilizada no laboratório para a separação de proteínas com base no seu peso molecular. É uma dessas técnicas que é comumente usado, mas não frequentemente totalmente compreendido. Vamos tentar resolver isso.
SDS-PAGE separa as proteínas de acordo com o seu peso molecular, com base nas suas taxas diferenciais de migração através de uma matriz de peneiração (um gel) sob a influência de um campo eléctrico aplicado.,
tornando a taxa de migração proteica proporcional ao peso Molecular
o movimento de qualquer espécie carregada através de um campo elétrico é determinado pela sua carga líquida, seu raio molecular e a magnitude do campo aplicado. Mas o problema das proteínas dobradas nativamente é que nem a carga líquida nem o raio molecular dependem do peso molecular. Em vez disso, a sua carga líquida é determinada pela composição de aminoácidos, ou seja, a soma dos aminoácidos positivos e negativos na proteína e no raio molecular pela estrutura terciária da proteína.,assim, em seu estado nativo, diferentes proteínas com o mesmo peso molecular migrariam a diferentes velocidades em um campo elétrico dependendo de sua carga e forma 3D.para separar proteínas em um campo elétrico baseado apenas no seu peso molecular, precisamos destruir a estrutura terciária reduzindo a proteína a uma molécula linear, e de alguma forma mascarar a carga líquida intrínseca da proteína. É aí que entra a SDS.,
O Papel da ficha de dados de segurança (et al)
ficha de dados de segurança é um detergente que está presente no SDS-PAGE tampão de amostra onde, junto com um pouco de ebulição, e de um agente redutor (normalmente TDT ou B-ME para quebrar a proteína-proteína ligações dissulfureto), compromete a estrutura terciária das proteínas. Isto traz as proteínas dobradas para moléculas lineares.
SDS também cobre a proteína com uma carga negativa uniforme,que mascara as cargas intrínsecas sobre os grupos R. A SDS liga-se uniformemente às proteínas lineares (cerca de 1.,4G de proteína SDS/ 1g), o que significa que a carga da proteína é agora aproximadamente proporcional ao seu peso molecular.
SDS também está presente no gel para se certificar de que, uma vez que as proteínas são linearizadas e suas cargas mascaradas, elas permanecem assim durante a execução.
o factor dominante na determinação de uma proteína revestida por SDS é o seu raio molecular., Proteínas revestidas por SDS têm sido mostradas como moléculas lineares, 18 Angstroms de largura e com comprimento proporcional ao seu peso molecular, de modo que o raio molecular (e, portanto, sua mobilidade no gel) é determinado pelo peso molecular da proteína. Uma vez que as proteínas revestidas por SDS têm a mesma taxa de carga em relação à massa, não haverá migração diferencial com base na carga.
a matriz de Gel
num campo elétrico aplicado, as proteínas tratadas com SDS irão agora mover-se para o ânodo positivo a taxas diferentes, dependendo do seu peso molecular., Estas diferentes mobilidades serão exageradas devido ao ambiente de alta fricção de uma matriz de gel.
Como o nome sugere, a matriz de gel utilizado para SDS-PAGE é de poliacrilamida, que é uma boa escolha, pois é um material quimicamente inerte e, crucialmente, podem ser facilmente feitos em uma variedade de concentrações para produzir diferentes tamanhos de poros, dando uma variedade de separação, condições que podem ser alteradas dependendo de suas necessidades. Deve lembrar-se que escrevi um artigo sobre o mecanismo de polimerização de acrilamida.,
O Sistema Tampão Descontínuo e o Gel de Empilhamento – Forro-Los na Linha de Partida
Para conduzir a corrente do cátodo (negativo) para o ânodo (positivo) através do gel, um buffer é, obviamente, necessária. A maior parte usamos o sistema de tampão laemmli descontínuo. “Descontínuo” significa simplesmente que o tampão no gel e no tanque são diferentes.Normalmente, o sistema é constituído por um gel de empilhamento a pH 6.8, tamponado por Tris-HCl, um gel de funcionamento tamponado a pH 8.8 por Tris-HCl e um tampão de eléctrodos a pH 8.3., O gel de empilhamento tem uma baixa concentração de acrilamida e o gel de rolamento uma maior concentração capaz de retardar o movimento das proteínas.
Então, o que está com todos aqueles que são diferentes de pH?
bem, a glicina pode existir em três estados de carga diferentes, positivos, neutros ou negativos, dependendo do pH. isto é mostrado no diagrama abaixo. O controle do Estado de carga da glicina pelos diferentes tampões é a chave para toda a coisa do gel empilhador.,
então aqui está como funciona o gel de empilhamento. Quando a energia é ligada, os íons glicina carregados negativamente no tampão de eletrodos pH 8.3 são forçados a entrar no gel de empilhamento, onde o pH é 6.8. Neste ambiente, a glicina muda predominantemente para o estado zwitteriônico (neutralmente carregado). Esta perda de carga faz com que se movam muito lentamente no campo elétrico.
os íons Cl (de Tris-HCl) por outro lado, movem-se muito mais rapidamente no campo elétrico e formam uma frente iônica que migra à frente da glicina., A separação de Cl-do contra – íon Tris (que agora está se movendo em direção ao ânodo) cria uma zona estreita com um gradiente de tensão íngreme que puxa a glicina por trás dela, resultando em duas frentes estreitas separadas de íons em migração; a frente Cl altamente móvel, seguida pela frente glicina mais lenta, principalmente neutra.,todas as proteínas da amostra de gel têm uma mobilidade eletroforética que é intermediária entre o extremo da mobilidade da glicina e Cl-, de modo que quando as duas frentes varrem bem a amostra, as proteínas estão concentradas na zona estreita entre as frentes Cl e glicina.e estão desligados!
esta procissão continua até atingir o gel em execução, onde o pH muda para 8.8. A este pH, as moléculas de glicina são carregadas negativamente e podem migrar muito mais rápido do que as proteínas., Então a frente glicina acelera através das proteínas, deixando-as na poeira.
O resultado é que as proteínas são despejados em uma faixa muito estreita na interface do empilhamento e execução de géis e desde que a execução de gel tem uma maior concentração de acrilamida, que retarda o movimento das proteínas de acordo com o seu tamanho, a separação começa.o que foi aquilo?
Se você ainda está se perguntando Por que o gel de empilhamento é necessário, pense no que aconteceria se você não usou um.,os poços de Gel de
têm cerca de 1cm de profundidade e é geralmente necessário enchê-los substancialmente para obter proteínas suficientes no gel. Assim, na ausência de um gel empilhador, sua amostra se sentaria em cima do gel de corrida, como uma faixa de até 1cm de profundidade.
em vez de estar alinhado e bater no gel de correr junto, isso significaria que as proteínas na sua amostra iria todos entrar no gel de execução em momentos diferentes, resultando em bandas muito manchadas.,o gel de empilhamento garante que todas as proteínas chegam ao gel de rodagem ao mesmo tempo para que as proteínas do mesmo peso molecular migrem como faixas apertadas.uma vez que as proteínas estão no gel em funcionamento, são separadas porque as proteínas de peso molecular mais elevada se movem mais lentamente através do gel poroso de acrilamida do que as proteínas de peso molecular mais baixas. O tamanho dos poros no gel pode ser alterado dependendo do tamanho das proteínas que você quer separar, alterando a concentração de acrilamida. Valores típicos são mostrados abaixo.,
Para uma maior separação de intervalo, ou proteínas que são difíceis de separar, de um gradiente de gel, que tem camadas de maior concentração de acrilamida, pode ser usado.