avaliação pulmonar. Os testes de função pulmonar (TFP) foram feitos com um Espirómetro de Brentwood no nosso escritório. Alguns pacientes foram submetidos a testes em outros lugares.teste imunológico. Testes foram realizados em laboratórios de Imunociências sob a direção de A. Wojdani, Ph. D.. Tendo em conta a importância destes testes no contexto desta avaliação, A metodologia é descrita em pormenor.,
preparação de formaldeído-albumina sérica humana (F-HSA) e conjugados de albumina sérica de formaldeído-bovino (F-BSA): foi efectuada uma comparação electroforética e imunoelectroforética da HSA, BSA com F-HSA e F-BSA para determinar a ocorrência de conjugação. A conjugação foi evidenciada pela mobilidade alterada de F-HSA, F-BSA quando comparada com HSA ou BSA, respectivamente. Além disso, o número de grupos de aminoácidos livres presentes na F-HSA ou F-BSA foi determinado pelo método de Snyder e Sobocinski (1975) e foi usado para avaliar a quantidade de substituição., O número de grupos aminoácidos ligados ao formaldeído foi de 26 para a HSA e 31 para a BSA. Neste cálculo, a formação de cruzamento intermolecular foi considerada.preparação de diisocianato de tolueno-albumina sérica humana (TDI-HSA) e conjugados de albumina sérica bovina (TDI-BSA): esta preparação foi semelhante aos métodos de Dewar e Baur (1982). De acordo com este método, 1g HSA ou 1g BSA foi dissolvido em 100 ml de uma solução tampão contendo cloreto de potássio (de 0,05 mol/l), borato de sódio (de 0,05 mol/l), PH 9,4 e resfriado a 4 C. Dioxano (10 ml) contendo 0.,Adicionaram-se então 15 ml de diisocianato de tolueno gota a gota durante um período de 3 horas, seguido da adição de 2 ml de etanolamina, centrifugação, filtração por diálise e liofilização. Semelhante à F-HSA e F-BSA, a conjugação foi confirmada por electroforese e determinação de grupos amino livres presentes no conjugado. O número de grupos amino ligados à TDI foi de 37 para a HSA e 43 para a BSA. Além disso, a análise espectrográfica do conjugado foi realizada de acordo com Zeiss et. al. (1980)., Verificou-se um aumento acentuado da absorção de 230 para 260 nm, o que indicou que a DDA se tinha tornado covalentemente ligada ao portador de proteínas. Este aumento na absorção concordou com a determinação do grupo NH2 apenas 76% para HSA e 81% para BSA
preparação do Anidrido trimelítico-albumina sérica humana (TMA-HSA) e Anidrido trimelítico albumina sérica bovina (TMA-BSA):
para preparar estes conjugados 25 mg. a TMA foi dissolvida em 0, 5 ml de dioxano e adicionada gota a gota a 25 mg de HSA ou BSA dissolvida em 5 ml de NaHCO3 a frio a 7% em água., Após agitação durante 60 minutos a 4 C, os conjugados foram dialisados contra quatro alterações de 0,1 M NaHCO3 e uma alteração de tampão. Finalmente, os conjugados foram filtrados e mantidos a -20 C até serem utilizados. Análises de OD de TMA-HSA e TMA-BSA foram feitas para determinar o número de resíduos de TMA ligados à proteína portadora correspondente. A concentração da proteína portadora foi convertida em Concentração molar com o peso molecular de HSA e BSA. A partir da razão da Concentração molar do ligante TMA e do transportador proteico, a razão de resíduos TMA por moléculas do transportador foi calculada., Estima-se que o TMA-HSA contenha 5 resíduos de TMA por moléculas de HSA e sete resíduos de TMA-BSA por molécula de albumina (Pien et al., 1988).
a Preparação de anidrido ftálico-albumina de soro humano (PA-HSA) e o anidrido Ftálico albumina de soro bovino (PA-BSA), conjuga:
Estas hapteno-conjuga foram preparadas pela adição de 75 mg de PA para um resfriado solução de 300 mg de HSA ou BSA em 100 ml de H2O. A mistura reacional foi agitada durante a noite, dialyzed contra PBS 0,1 M, utilizando tubulações, com um corte de 8000 dalton. Usando o método de Zeiss et. al. (1977) os rácios molares foram calculados., Verificou-se que os rácios molares eram 22/28 para a PA/HSA e 25/30 para a PA/BSA.preparação de conjugados de anel de benzeno HSA (B-HSA) e anel de benzeno BSA (B-BSA): 40 mg para estas preparações. o ácido p-aminobenzóico foi dissolvido em 2 ml de HCL 1 N e arrefecido por imersão num banho de gelo. Adicionou-se uma solução a frio de 14 mg/ml no sentido gota a gota. Após cada adição, a mistura foi agitada por 30 segundos. Em paralelo, um grama de HSA ou BSA foi dissolvido em ácido bórico 0,16 M tampão de cloreto de sódio (0-15 M) PH 9,0 (PH foi aumentado com NaOH)., Os copos contendo as soluções de albuminas foram cercados por um banho de gelo em agitador magnético. A solução de sal de diazónio foi adicionada gota a gota, com agitação rápida na solução de proteína fria. Após a adição de cada gota, o PH é reajustado para 9,0 a 9,5 com um NaOH normal. Após a adição de toda a solução, permitiu-se que a reacção continuasse com agitação lenta durante, pelo menos, uma hora com novas adições da solução de NaOH e mantendo o PH entre 9,0 e 9,5., Moléculas pequenas não reagidas foram removidas por diálise extensa ou por passagem através de uma coluna de sephadex G-25 na sala fria, com uma solução de sal isotônica como o tampão de eluição. Análises de OD do desenvolvimento de cor laranja de B-HSA e B-BSA foram feitas para determinar o número de resíduos B ligados à proteína portadora correspondente. A quantidade de substituição B para HSA foi de aproximadamente 41 e para BSA 53 (Migrdichian, 1957).determinação de anticorpos: anticorpos específicos contra f-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA e B-HSA foram analisados por um ensaio ELISA não-competitivo., Poços de placas de microtitulação (Dynatech, Alexandria, VA) foram revestidos com 100 1 do antigen soluções (100 g/ml) em PBS 0,1 M PH 7,2 durante a noite a 4 C. as Placas foram lavadas 4 vezes com 0,1 M de PBS contendo 0,05% de tween 20 entre cada passo. Os locais de absorção livre foram bloqueados com 2% de albumina sérica bovina sem protease à temperatura ambiente durante 4 horas e armazenados a -20 C até serem utilizados.,
Procedimento Analítico:
O procedimento incluía o seguinte: (1) de lavar roupa quatro vezes, (2) a adição de 100 a 1 de soro diluído (1:2 para IgE e 1:100 para IgM e IgG) em PBS tween-20 com 1% de BSA (3) incubação de 4 horas a 20 ° C, seguido de lavagem de 4 tempos (4) além de 100 a 1 de um ideal de diluição de fosfatase alcalina rotulado de afinidade purificada de cabra anti-humano IgE ( ) (1:200), IgM (1:500) e anti IgG (1:1000), adquiridos a partir de KPI (Maryland) (5) incubação por 120 minutos, a 20 C, (6) de lavar roupa 6 vezes, (7) a adição de 100 a 1 de P-nitrofenil fosfato (Sigma Chemical Co.,) (8) incubação durante 60 minutos a 20 C (9) adição de 50 1 de 3 n Solução de hidróxido de sódio, e (10) leitura em duplicado. Os resultados foram calculados com base em absorvências de amostras duplicadas de 405 nm, utilizando um leitor de microtitros. Todas as amostras foram lidas contra um antigénio HSA como um controlo da ligação não específica A F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA e B-HSA. Os resultados foram expressos em título. O título é a última diluição do soro que confere absorvância duas vezes do controlo da HSA.,estudos de especificidade e inibição cruzada: para a determinação da especificidade de anticorpos foi realizado um estudo de inibição cruzada. Os soros positivos para cada conjugado hapten-proteína foram executados após incubação e precipitação adequadas, com incrementos dez vezes maiores de hapten ligados HSA ou BSA como inibidores para cobrir a gama de anticorpos contra o excesso de antigénio. Este intervalo foi entre 50 g a 1000 g para hapten-BSA e 80 g a 1000 g para hapten-RSA., Após incubação a 37 C e remoção do precipitado por centrifugação, as amostras do estudo de inibição cruzada antes e depois foram colocadas em placas com alvéolos revestidos com o conjugado específico. As etapas seguintes foram seguidas, como descrito acima, para o estudo ELISA.a ligação de anticorpos IgG e IgM a diferentes conjugados foi inibida por hapten-HSA ou hapten-BSA de 36-85%. Numa dada concentração, tanto o hapten-HSA como o hapten-BSA inibiram o nível de anticorpos de maneiras semelhantes.,foi observada inibição parcial da ligação dos anticorpos IgE a diferentes conjugados de hapten quando o soro foi pré-incubado com hapten-HSA ou hapten-BSA. Esta observação incompleta da inibição do anticorpo IgE foi principalmente relacionada com a indisponibilidade do soro com títulos elevados de IgE contra diferentes produtos químicos em nosso laboratório.,
Determinação de Níveis Normais de Anticorpos (Controles):
com Base nos procedimentos acima, 160 amostras de doadores de sangue de indivíduos saudáveis, de ambos os sexos, entre as idades de 22-55, foram examinados por níveis de anticorpos contra o F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA, e B-HSA. O título médio foi 1: 800 400 para IgG, 1:3200 1600 para IgM e 1: 8 4 para IgE. Assim, em nossos títulos laboratoriais maiores que 1:1600 para IgG, 1:6400 para IgM e 1:16 para IgE são considerados positivos.,num dado doente, os aumentos ou diminuições dos títulos de anticorpos em mais de uma diluição foram considerados significativos (Ver tabelas).Contagem de subconjuntos de linfócitos:
um único citómetro de fluxo laser (perfil Epico: “Coulter Epics”, Inc., Hialeah, FL) que discrimina a dispersão de luz de ângulo frontal e Direito, bem como duas cores, foi usado com um pacote de software (Quad Stat: Coulter). As populações de células mononucleares foram determinadas pela imunofluorescência directa de duas cores utilizando uma técnica de coloração de sangue total com o anticorpo monoclonal apropriado e citometria de fluxo (Fletcher et al.,, 1989) Os seguintes pares de isotiocianato de fluoresceína (FITC), ou ficoeritrina (PE)-anticorpos monoclonais conjugados (Coulter imunologia) foram selecionados: T11-RDI/B4-FITC, T4-RDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-RDI e T11-FITC/Tal-PE, para a determinação de células-T/de células B, T-helper/T-supressores, NKHT3+ /NKHY3 e para substituição da via de ativação de linfócitos, respectivamente.
para monitorizar os marcadores linfocitários, foram definidos mapas bat na população de linfócitos da dispersão de luz do ângulo frontal versus um histograma de dispersão de 90 luzes., Foi determinada a percentagem de células manchadas positivamente para cada par marcador, bem como a percentagem de células duplamente manchadas. As estimativas do número absoluto de linfócitos positivos para os respectivos marcadores de superfície foram determinadas multiplicando a contagem de células de linfócitos periféricos pela percentagem de células manchadas positivamente para cada par marcador. Além disso, foi determinada a percentagem de células duplamente manchadas., As estimativas do número absoluto de linfócitos positivos para os respectivos marcadores de superfície foram determinadas multiplicando a contagem de células de linfócitos periféricos pela percentagem de células positivas para cada marcador de superfície.a medição dos anticorpos proteicos básicos anti-mielina: a proteína básica da mielina humana (HMBP) foi preparada pelo método de Diebler et al. (1972) and checked for purity by polyacrylamine gel electroforese. O anti-soro para HMBP foi induzido em coelhos por injecção repetida de HMBP no adjuvante completo de Freund., Actividade do anticorpo em coelho sera e do paciente amostras foi detectada pela adição de diferentes diluições (1:100 a 1:10,000) de soros para poços de uma placa de microtitulação previamente revestidos com HMBP da seguinte forma: HMBP 250 g/ml, foi dissolvido em carbonato de tampão, PH 9,6 e 200 l desta solução foram adicionados a cada poço. Após incubação, lavagem e bloqueio como acima indicado, foram adicionados 200 1 de soro diluído de coelho ou de soro humano aos poços. Após incubação de 1 hora a 37 C, os soros foram sacudidos dos poços e depois lavados 5 vezes com solução de lavagem., Foram adicionados ao poço apropriado 200 1 de IgG, IgM ou IgA (diluição óptima) de cabra anti-coelho ou cabra anti-humana conjugada com peroxidase. Após incubação e lavagem repetida de 200 1 de substrato ABTS foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente e lidas em um leitor de microtitros a 405 tun comprimento de onda. Utilizando anti-soros de coelho, foi traçada uma curva de titulação e os soros do doente foram comparados a esta curva padrão., Com base em mais de 200 controlos e nas determinações da amostra de doentes, os litros superiores a 1:2000 para a IgA, 1:5000 para a IgM e 1:8000 para a IgG foram considerados positivos.