Insights MHC susceptibilidade a doenças auto-imunes: multa de mapeamento de resultados, epistasia, e a doença de biologia
as Associações entre o MHC e doenças auto-imunes relatados na década de 1970, foram alguns dos primeiros descritas associações genéticas , e eles continuam a ser os mais fortes fatores de risco para doenças auto-imunes., Após o desenvolvimento de plataformas de genotipagem de ecrã largo e oleodutos de imputação, a imputação MHC e o mapeamento fino foram realizados em populações europeias e asiáticas para doenças autoimunes mais comuns, incluindo RA , CeD , psoríase , espondilite anquilosante (AS) , lúpus eritematoso sistémico (SLE) , T1D , esclerose múltipla (MS) , doença de Graves , Doença inflamatória intestinal (IBD) e dermatomiosite (DM) . O quadro 1 mostra as principais variantes associadas e loci independentemente associadas para doenças auto-imunes.,
In 2012, a pioneering MHC fine-mapping study, performed in individuals of European ancestry with RA, confirmed the strongest association with the class II HLA-DRB1 gene, as well as other independent associations. Anteriormente, um risco aumentado de ar foi relatado para um conjunto de sequências consensuais de aminoácidos nas posições 70-74 no gene HLA-DRB1, conhecido como o locus “epítopo compartilhado”. Os dados imputados revelaram que as associações mais significativas eram com dois aminoácidos na posição 11, localizados num sulco de ligação peptídica do heterodímero HLA-DR., This suggested a functional role for this amino acid in binding the RA-triggering antigen. Seguiram-se estudos de cartografia fina semelhantes para outras doenças auto-imunes (Quadro 1).
em geral, na maioria das doenças auto-imunes, as estratégias de mapeamento fino confirmaram o principal local associado relatado pela análise do serótipo dentro de um determinado local MHC. Tais estratégias também permitiram a identificação de variantes alélicas ou aminoácidos específicos, bem como Variantes independentes em diferentes classes de HLA., Por exemplo, no CeD, a associação mais forte foi com o DQ-DR locus conhecido, e cinco outros sinais independentes nas classes I e II também foram identificados. O CeD é a única doença auto-imune para a qual o antigénio, o glúten, é conhecido e bem estudado. Glúten é um produto alimentar em trigo, cevada e centeio. É digerida no intestino e desamidada pelas enzimas transglutaminases tecidulares de modo que se encaixa perfeitamente nos bolsos de ligação de um determinado heterodímero dq de risco-CeD (codificado pelos haplotipos DQ2.2, DQ2.5 e DQ8)., Esta associação foi confirmada pela MHC fine-mapping, que indicou papéis para quatro aminoácidos nos genes DQ com as associações independentes mais fortes para o risco de CeD . Do mesmo modo, as principais associações foram determinadas para T1D, MS e SLE dentro do MHC class II locus (as associações para estas três doenças são para um HLA-DQ-DR haplótipo particular), e há também associações independentes, mas mais fracas com as regiões de classe I e/ou III., In DM, fine mapping in an Asian population identified MHC associations driven by variants located around the MHC class II region, with HLA-DP1 * 17 being the most significant . Em contraste, as associações primárias e mais fortes na psoríase e como eram para as moléculas MHC classe I, enquanto associações independentes para o locus classe I também foram relatadas para a doença de IBD e Graves., As variantes da classe III são pouco implicadas em doenças auto-imunes, mas várias associações na região MHC classe III foram vistas para MS; por exemplo, a associação a rs2516489 pertencente ao haplótipo longo entre genes MICB e LST1. O sinal de associação para rs419788-T na região de classe III, gene SKIV2L, também foi implicado na susceptibilidade ao SLE, representando um locus novo identificado por mapeamento fino em trios Pais-Filhos do Reino Unido ., Um sinal de associação independente para a classe III também foi identificado (rs8192591) por uma grande meta-análise de casos e controles europeus SLE e, especificamente, a montante do NOTCH4 . No entanto, são necessários mais estudos para explicar como estas variações genéticas contribuem para a predisposição para a les.além de identificar variantes independentes, os estudos de mapeamento fino MHC permitem a análise de efeitos epistáticos e não aditivos no locus., Estes fenômenos ocorrem quando o efeito de um alelo na manifestação da doença depende do genótipo de outro alelo no locus (efeito não aditivo), ou no genótipo do gene “modificador” em outro locus (epistase). Os efeitos MHC não aditivos foram estabelecidos no CeD, no qual o conhecimento do glúten era o antigénio causal ofereceu uma vantagem na investigação da estrutura específica do antigénio do DQ-heterodímero. O risco CeD é mediado pela presença de vários haplotipos HLA-DQ, incluindo o DQ2.5, DQ2.,2, e haplotipos DQ8, que formam o bolso específico que eficientemente apresenta glúten às células T. Estes haplótipos podem ser codificados em cis, quando ambos DQA1 e DQB1 estão localizados no mesmo cromossomo, ou trans, quando eles estão localizados em diferentes cromossomos. Algumas variantes alélicas da DQ conferem susceptibilidade à DCE apenas em combinação com certos outros haplotipos, formando uma trans-combinação predisposta à DC. Por exemplo, o HLA-DQA1*0505-DQB1*0301 (DQ7) só confere risco ao DCE se for combinado com DQ2.2 ou DQ2.5, contribuindo para a formação de haplotipos susceptíveis em trans., Em particular, a heterozigosidade DQ7 / DQ2.2 confere um maior risco de CeD do que homozigosidade para qualquer um destes alelos, e é um exemplo de um efeito não aditivo para ambos alelos.
Ao contrário do CeD, os haplotipos exatos e suas propriedades associadas permanecem desconhecidos para a maioria das outras doenças auto-imunes; portanto, a análise de efeitos não-aditivos pode produzir novos insights sobre antigénios potencialmente causadores de doenças. Lenz et al., forneceu provas de efeitos significativos não aditivos para doenças auto-imunes, incluindo DCE, ar, T1D e psoríase, que foram explicadas por interações entre certos alelos clássicos do HLA . Por exemplo, interacções específicas que aumentam o risco de doença T1D foram descritas entre os genotipos HLA-DRB1*03:01-DQB1*02:01/DRB1*04:01-DQB1*03:02 e para várias combinações dos HLA-DRB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1 haplotipos ., Em AS, foi observada interacção epistática para combinações de HLA-B60 e HLA-B27, indicando que os indivíduos com o genótipo HLA-B27+/HLA-B60+ têm um elevado risco de desenvolvimento de AS . Além disso, um estudo recente no MS encontradas evidências de interações envolvendo classe II alelos: HLA-DQA1*01:01-HLA-DRB1*15:01 e HLA-DQB1*03:01-HLA-DQB1*03:02, embora a sua contribuição para a falta de herdabilidade no MS foi menor .foram também notificadas interacções Epistáticas entre os alelos MHC e não MHC em várias doenças auto-imunes, incluindo Les, em, AS e psoríase., Por exemplo, numa grande coorte Europeia de doentes com LES , foi identificada a interacção epistática mais significativa entre a região MHC e o antigénio linfócito T citotóxico 4 (CTLA4), que é upregulado nas células T ao encontrar APCs. Isto realça que a apresentação adequada do antigénio e a activação das células T são importantes na patogénese da les . Notavelmente, interações entre os genes MHC classe I e receptor específico de imunoglobulina assassina (KIR) são importantes na predisposição para doenças auto-imunes, tais como artrite psoriática, esclerodermia, sarcoidose e T1D ., Os genes KIR são codificados pelo complexo receptor leucocitário no cromossoma 19q13 e expressos em células assassinas naturais e subpopulações de células T. Finalmente, as interações epistáticas entre a classe MHC I e o ERAP1 foram descritas como psoríase e doença de Behçet .a Associação de novas variantes MHC e a identificação de efeitos de interacção dentro da MHC estão a aumentar a nossa compreensão da biologia subjacente às doenças auto-imunes e inflamatórias., O mapeamento fino do locus principal associado no haplotipos HLA-DQ-DR permitiu determinar as principais posições dos aminoácidos na DQ ou na DR heterodímero. A identificação de aminoácidos específicos leva a uma melhor compreensão da estrutura e da natureza dos potenciais antigénios para doenças auto-imunes ou inflamatórias, e estes podem então ser testados através de testes de ligação e modelagem molecular., O facto destas posições estarem localizadas em ranhuras de ligação peptídica sugere que têm um impacto funcional na apresentação do peptídeo antigénico às células T, quer durante o desenvolvimento tímico inicial, quer durante as respostas imunitárias periféricas . Além disso, a análise dos efeitos não aditivos nos loci associados à MHC oferece a possibilidade de identificar bolsas de ligação específicas aos antigénios e sequências-chave de aminoácidos., Por exemplo, a identificação da sequência protectora de cinco aminoácidos DERAA como uma sequência chave no Alelo HLA-DRB1:13 da RA-protective, e a sua semelhança com peptídeos humanos e microbianos, levaram à identificação da vinculina (citrulinada) e de algumas sequências patogénicas como novos antigénios RA .a identificação de sinais independentes nas classes I e III da MHC para muitas doenças auto-imunes implica que estas doenças envolvem novos mecanismos de Via., Por exemplo, a associação de DCE a moléculas de classe I sugere um papel para leucócitos intra-epiteliais inatos que são restritos à expressão de classe I e que são importantes na integridade epitelial e no reconhecimento patogênico . Associações de classe I com ar, T1D e outras doenças auto-imunes sugerem que as células citotóxicas CD8+ estão envolvidas na patogênese da doença, bem como as células T auxiliares CD4+.a descoberta dos efeitos epistáticos do MHC e do loci não-MHC também pode lançar luz sobre os mecanismos da doença., Por exemplo, as variantes de perda de funções do ERAP1 reduzem o risco de como em indivíduos que são HLA-B27-positivos e HLAB-40:01-positivos, mas não em portadores de outros haplotipos de risco . Foram também observados efeitos epistáticos semelhantes na psoríase, de modo que os indivíduos que possuem variantes no ERAP1 apresentaram um risco aumentado apenas quando também apresentavam um alelo de risco HLA-C. De acordo com estas observações, estudos em ratos mostraram que o ERAP1 determina a clivagem de epítopos relacionados de tal forma que eles podem ser apresentados pela molécula HLA-B27 ., A confirmação de que certos epítopos devem ser clivados pelo ERAP1 para serem apresentados eficientemente pelas células CD4+ e CD8+ será um passo crítico na identificação de gatilhos específicos para doenças auto-imunes.as recentes descobertas de associações genéticas entre os alelos MHC e as doenças auto-imunes são notáveis e oferecem o potencial para identificar os antigénios causadores de doenças. Este seria um passo importante no sentido do desenvolvimento de novos tratamentos e da prevenção de doenças., No entanto, ainda não entendemos exatamente como a maioria dos alelos e haplotipos associados funcionam, e estudos funcionais extensos são necessários para clarificar o seu envolvimento na doença.
explicou a hereditariedade através de loci MHC independente para doenças auto-imunes
Heritabilidade é uma estimativa de quanta variação em uma doença ou fenótipo pode ser explicado por variantes genéticas., Estimar a hereditariedade é importante para prever doenças, mas, para doenças comuns, é desafiador e depende de preferências metodológicas, prevalência de doenças, e interações gene–ambiente que diferem para cada fenótipo . Por conseguinte, é difícil comparar as estimativas de hereditariedade com as doenças. No entanto, para muitas doenças, foram feitas estimativas sobre a quantidade de variância fenotípica que pode ser explicada pelo locus principal e pela MHC loci independente .,
para doenças auto-imunes com um sinal de associação principal vindo de um locus de classe II, a variância relatada explicada por alelos MHC varia de 2 a 30% . O efeito mais forte é relatado para T1D, no qual os haplotipos HLA-DR e HLA-DQ explicam 29,6% da variância fenotípica; loci independentemente associado em HLA-a, HLA-B e HLA-DPB1 juntos explicam cerca de 4% da variância fenotípica total, enquanto todos os outros loci não-MHC são responsáveis por 9% ., Da mesma forma, no DCE, que tem o mesmo haplótipo principal associado ao T1D, o HLA-DQ-DR locus explica 23 − 29% da variância da doença (dependendo da prevalência estimada da doença, que é de 1 − 3%), enquanto outros alelos MHC explicam 2 − 3%, e os loci não-MHC explicam 6,5 − 9% . Em ar seropositivo, 9,7% da variância fenotípica é explicada por todos os haplotipos associados, enquanto um modelo que inclui três posições de aminoácidos em DRB1, juntamente com aminoácidos associados independentemente em HLA-B e HLA-DP loci, explica 12,7% da variância fenotípica ., Isto indica que as variantes não DR explicam uma proporção de hereditariedade comparável à de outros loci não MHC (4,7 − 5,5% em asiáticos e europeus) . Os efeitos não aditivos dos haplotipos DQ-DR também podem explicar uma proporção substancial de variância fenotípica: 1,4% (RA), 4,0% (T1D) e 4,1% (DCE). Em MS, o principal Alelo associado, DRB1*15:01, representa 10% da variância fenotípica, enquanto todos os alelos em DRB1 explicam 11,6%. Um modelo que inclui todas as variantes independentes (e as localizadas nas classes I, II e III) explica 14, 2% da variância total na suscetibilidade ao EM .,
em Les, A proporção de variância explicada pelo MHC é notavelmente menor, com apenas 2% , e é principalmente devido a variantes de classe II. No IBD, a associação com a MHC é mais fraca do que em doenças autoimunes clássicas, com uma menor contribuição observada na doença de Crohn (CD) do que na colite ulcerativa (UC) . As variantes principais e secundárias podem agora explicar 3,1% da hereditariedade em CD e 6,2% em UC, que é duas a dez vezes maior do que anteriormente atribuído pela análise do efeito principal em qualquer doença (0,3% em CD e 2,3% em UC para o efeito SNP principal) ., Entre todas as doenças aqui discutidas, o principal efeito do haplótipo associado é muito mais forte do que os efeitos independentes de outros loci (com exceção do IBD, em que a associação MHC é mais fraca em geral). No entanto, a MHC loci independente pode agora explicar uma quantidade comparável da variância da doença à explicada pelos genes não associados à MHC conhecidos até agora.,
Insights into MHC susceptibility for infectious diseases: GWAS, fine-mapping results, and epistasis
In principle, an infectious disease is caused by interactions between a pathogen, the environment, and host genetics. Aqui, discutimos as associações genéticas MHC relatadas em doenças infecciosas do GWAS (Tabela 2) e como estes achados podem explicar o aumento da susceptibilidade ou proteção afetando as respostas imunitárias humanas. É por isso que certas classes MHC são importantes em doenças infecciosas., Constatamos que foram encontradas menos associações MHC para doenças infecciosas do que para doenças auto-imunes, principalmente devido ao menor número de coortes para doenças infecciosas. Assim, ainda têm de ser realizados extensos estudos de cartografia fina (e imputação), com excepção de alguns estudos sobre infecções como o vírus da Imunodeficiência Humana (VIH), o vírus da hepatite B humana (VHB), o vírus da hepatite C humana (VHC), o vírus do papiloma humano (HPV), a seropositividade e a tuberculose .,
a Partir de um ponto de vista genético, um dos mais estudados doenças infecciosas é a infecção pelo HIV. A MHC class I loci tem fortes efeitos no controle e aquisição do HIV , no set point da carga viral e na não progressão da doença nos Europeus e em populações multiétnicas (europeus , afro-americanos , hispânicos e chineses) ., Um GWAS de uma população afro-americana indicou um mecanismo semelhante de HIV-1 em Europeus e afro-americanos: cerca de 9,6% da variação observada no ponto de conjunto da carga viral pode ser explicado pelo HLA-B*5701 em europeus , enquanto cerca de 10% pode ser explicado pelo HLA-B*5703 em afro-americanos . Em contraste, as associações MHC e aminoácidos imputados identificados em Europeus e afro-americanos não foram replicados em populações Chinesas, possivelmente por causa das freqüências de alelos variados ou menores destes SNPs no povo chinês ., Uma forte associação à sequência B (MICB) relacionada com os polipeptídeos classe I da MHC também foi revelada por um recente GWAS para a síndrome de choque de dengue (DSS) em crianças vietnamitas . Este resultado foi replicado em pacientes tailandeses, indicando que o MICB pode ser um forte fator de risco para a DSS no Sudeste Asiático .
HLA-DP e HLA-DQ loci, juntamente com outros MHC ou não-MHC loci (TCF19, EHMT2, HLA-C, HLA-DOA, UBE2L3, CFB, CD40, e NOTCH4) estão consistentemente associados com a susceptibilidade à infecção pelo VHB em populações Asiáticas ., Foram também confirmadas associações significativas entre a depuração HLA-DPA1 locus e a depuração do VHB em populações independentes Da Ásia Oriental . Um estudo de mapeamento fino dos dados GWAS existentes de pacientes chineses de Han com infecção crônica pelo VHB usou o SNP2HLA como ferramenta de imputação e um painel de referência pan-asiático. Revelou quatro associações independentes nas posições 84-87, 15, rs400488 em HCG9 e 13; juntas, estas quatro associações poderiam explicar mais de 72,94% da variância fenotípica causada por variações genéticas ., Outro estudo recente utilizando dados imputados de indivíduos japoneses indicou que os alelos de classe II estavam mais fortemente associados à infecção crónica pelo VHB do que os alelos de classe I (ficheiro adicional 1) . Da mesma forma, o HLA-DQ locus influencia a eliminação espontânea da infecção por VHC em coortes de ascendência europeia e africana, enquanto o DQB1*03:01, que foi identificado pela genotipagem HLA juntamente com o não-MHC IL28B, pode explicar 15% dos casos espontâneos de eliminação da infecção por VHC . O HLA-DQB1 * 03 também confere susceptibilidade ao VHC crónico nos japoneses ., Um GWAS em uma população europeia revelou que a seropositividade HPV8 é influenciada pela região MHC classe II. No entanto, o HPV tipo 8 apresentou uma maior prevalência de seropositividade do que outros tipos de HPV ao nível da população, o que levou a um poder limitado para detectar associações com outros tipos de HPV. O mapeamento fino utilizando a mesma população europeia que no GWAS revelou associações significativas com seropositividade HPV8 e HPV77, mas apenas com alelos MHC classe II, não com alelos de classe I. Isto indica um papel central para as moléculas de classe II nas respostas imunitárias de anticorpos na infecção por HPV., Notavelmente neste estudo, a imputação foi realizada usando HLA * IMP:02 e painéis de referência do projeto HapMap e da coorte britânica de nascimento de 1958, bem como usando SNP2HLA com outro painel de referência do T1DGC. Ambas as ferramentas de imputação forneceram resultados comparáveis, destacando assim o importante papel dos alelos da classe II da MHC na resposta aos anticorpos à infecção pelo HPV .
A GWAS on lepra in Chinese populations pointed to significant associations with HLA-DR-DQ loci ; these results were replicated in an Indian population ., O mapeamento fino da MHC mostrou que as variantes da classe II da HLA estavam extensivamente associadas com a susceptibilidade à lepra em Chineses, com a variante HLA-DRB1*15 sendo a mais significativa . As variantes de classe II da HLA também influenciam a infecção micobacteriana tuberculose em populações europeias e africanas . O mapeamento fino identificou o haplótipo DQA1 * 03, que contém quatro variantes missense e contribui para a susceptibilidade à doença ., Uma meta-análise mostrou que cinco variantes (HLA-DRB1*04, *09, *10, *15, e * 16) aumentar o risco de tuberculose, especialmente nas populações da Ásia Oriental, enquanto o HLA-DRB1*11 é Protector .usando uma população do Brasil, o primeiro GWAS em leishmaniose visceral revelou que a classe II HLA-DRB1-HLA-DQA1 locus tinha o sinal de associação mais forte, que foi replicado em uma população indiana independente ., Esta associação comum sugere que brasileiros e indianos compartilham fatores genéticos determinantes que são independentes das diferentes espécies de parasitas nestas regiões geograficamente distintas.por último, as interacções epistáticas entre os alelos da classe I MHC e certos alelos KIR (entre KIR3DS1 combinados com alelos HLA-B) estão associadas a uma progressão mais lenta para a síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e a uma melhor resolução da infecção por VHC (entre KIR2DL3 e o seu antigénio C do leucócitos humanos, grupo 1, HLA-C1) .,Insights into the biology of infectious diseases
Associations with the MHC class I locus suggest a critical role for CD8+ T-cell responses in major viral infections such as HIV, dengue, and VHC. Este papel crítico das respostas das células T CD8+ na infecção pelo VIH é reflectido pela lenta progressão da doença observada em indivíduos infectados devido ao aumento das respostas das células T CD8+ que são específicas das proteínas do VIH conservadas, tais como o Gap p24 ., Curiosamente, cinco dos seis resíduos de aminoácidos (ficheiro adicional 1) identificados como associados ao controlo do VIH encontram-se na ranhura de ligação do péptido classe I da MHC, o que implica que a variação do MHC afecta a apresentação do péptido às células CD8+ T. Em particular, o aminoácido na posição 97, que se encontra no chão da ranhura em HLA-B, foi mais significativamente associado ao controle do HIV (P = 4 × 10-45) . Este aminoácido também está implicado na dobragem de proteínas MHC e na expressão da superfície celular ., Uma associação encontrada na doença de dengue grave também sublinha o papel das células T CD8+ na patogênese da doença: alelos de classe I que estavam associados a um risco aumentado de doença de dengue grave também foram associados com respostas mais fracas de células T CD8+ em uma população do Sri Lanka de uma área de doença de dengue hiper-endêmica . No VHC, semelhante aos alelos protectores contra a infecção pelo VIH , o HLA-b*27 apresenta os epítopos mais conservados do VHC para provocar respostas citotóxicas fortes das células T, reduzindo assim a capacidade do VHC para escapar às respostas imunitárias do hospedeiro .,as associações entre variantes genéticas na região de classe II da MHC e a susceptibilidade à doença implicam que a alteração da apresentação do antigénio ou moléculas instáveis da classe II da MHC contribuem para respostas CD4+ das células T insuficientes e, subsequentemente, para uma maior susceptibilidade às infecções. Por exemplo, as alterações dos aminoácidos nas posições HLA-DPß1 e HLA-DRß1 na ranhura de ligação aos antigénios que influenciam a infecção pelo VHB podem resultar numa apresentação defeituosa dos antigénios às células CD4+ T ou numa diminuição da estabilidade das moléculas MHC de classe II, aumentando assim a susceptibilidade à infecção pelo VHB ., As respostas das células T CD4+ também são críticas nas infecções micobacterianas, tal como foi descrito para a lepra e a tuberculose . Nomeadamente, macrófagos derivados de monócitos tratados com live Mycobacterium leprae mostrou três principais respostas que explicam a persistência da infecção: downregulation de certas citocinas pró-inflamatórias e moléculas MHC classe II (HLA-DR e HLA-DQ), preferencialmente preparado regulamentar as respostas das células T, e reduzido Th1-tipo e citotóxica de células T função ., Os macrófagos isolados das lesões de pacientes com a forma mais grave da doença, lepra lepromatosa, também mostraram menor expressão de moléculas MHC classe II, fornecendo mais evidências de que a apresentação defeituosa do antigénio por estas moléculas leva a uma infecção mais persistente e mais grave por M. leprae .recentemente, foi demonstrado que as células T CD4+ são essenciais para a produção óptima de IFNy pelas células T CD8+ nos pulmões dos ratinhos infectados com M., tuberculose, indicando que a comunicação entre estas duas populações de células efectoras distintas é fundamental para uma resposta imunitária protectora contra esta infecção . A alteração do processamento e apresentação do antigénio a partir de macrófagos infectados com Leishmania (que são as principais células residentes para este parasita) para as células T CD4+ pode explicar o aumento da susceptibilidade à leishmaniose . A associação entre a seropositividade do HPV e a região MHC de classe II também sugere que as moléculas de classe II se ligam e apresentam antigénios exógenos de forma mais eficaz a um subconjunto de células T CD4+ conhecidas como Th2., Estas células Th2 ajudam os linfócitos B a diferenciar-se nas células plasmáticas e a segregar anticorpos contra o vírus do HPV.em apoio da hipótese de que os efeitos genéticos nas células CD8+ (classe I) e CD4+ (classe II) modificam a predisposição para as infecções, deve notar-se que algumas doenças infecciosas, como o VIH, o VHB, o VHC e a lepra, mostram associações a mais de uma das classes clássicas MHC e, em alguns casos, as associações diferem entre as populações (Quadro 2)., Além disso, devem ser consideradas as diferenças entre os genótipos virais e bacterianos na mesma infecção, que desempenham um papel na determinação dos efeitos potencialmente protectores. No geral, associações com múltiplos loci MHC refletem a natureza complexa e interativa das respostas imunitárias do hospedeiro quando o hospedeiro encontra um patógeno.