O que é a citometria de fluxo (análise FACS)?

originalmente desenvolvido no final da década de 1960, a citometria de fluxo é uma popular técnica analítica de biologia celular que utiliza células de luz para contar e perfis em uma mistura de fluidos heterogêneos. Citometria de fluxo é um método particularmente poderoso porque permite que um pesquisador para rapidamente, com precisão, e simplesmente coletar dados relacionados a muitos parâmetros de uma mistura de fluidos heterogêneos contendo células vivas.,citometria de fluxo é usada extensivamente ao longo da vida e ciências biomédicas, e pode ser aplicada em qualquer cenário onde um pesquisador precisa traçar rapidamente um perfil de uma grande população de células soltas em um meio líquido. Por exemplo, em citometria de fluxo imunológico é usado para identificar, separar e caracterizar vários subtipos de células imunes em virtude de seu tamanho e morfologia.quando é necessária informação adicional, anticorpos marcados com corantes fluorescentes e levantados contra antigénios de superfície celular altamente específicos (ex., clusters of differentiation or CD markers) can be used to better identify and segregate specific sub-populations within a larger group.

num citómetro de fluxo

• As células de amostra são passadas através de um canal estreito uma de cada vez.a luz é utilizada para iluminar as células do canal.uma série de sensores detectam os tipos de luz que são refratados ou emitidos pelas células.os dados adquiridos pelos sensores são compilados e integrados para construir uma imagem completa da amostra.,

FACS Anticorpos atualmente utilizado para a Pesquisa

Diferentes Tipos de Luz utilizada em um meio de Citometria de Fluxo Experimento

Um citómetro de fluxo usa refratado ou luz emitida para contar e identificar as células. Saiba mais sobre os diferentes tipos de luz utilizados em um experimento de citometria de fluxo nas seguintes figuras.,

Forward Scatter

o espalhamento da luz é refratada por uma célula no canal de fluxo e continua ao longo do caminho da luz (i.e. A mesma direção que a luz era originalmente da viagem). A luz espalhada para a frente é detectada por um sensor no caminho da luz, e é tipicamente usado para identificar o tamanho das partículas.

luz espalhada para a frente é mais comumente usado para detectar o tamanho do objeto no caminho da luz., Objetos maiores que vai produzir mais para a frente, espalhamento de luz de objetos menores, e células maiores vai ter uma forte frente de dispersão do sinal

a Dispersão Lateral

do Lado do espalhamento de luz a luz passa de a fonte de iluminação para o canal de fluxo, é refratada por células em uma direção que é fora do original do caminho da luz. A luz de dispersão lateral é detectada por um sensor que é ortogonal ao caminho de luz original.,

luz de dispersão lateral é geralmente usada para determinar a granularidade e complexidade da célula no caminho da luz. As células altamente granulares com uma grande quantidade de complexidade interna, como os neutrófilos, produzirão mais luz dispersa lateral, e um sinal de dispersão lateral mais elevado do que as células com uma baixa granularidade e complexidade.

de Fluorescência de Emissão

Fluorescente de luz emitida pelas moléculas fluorescentes após excitação por um compatível com o comprimento de onda do laser., A luz fluorescente pode ter origem em materiais fluorescentes naturais na célula, ou pode ter origem em corantes fluorescentes ou anticorpos com fluorescência que tenham sido utilizados para rotular uma estrutura específica na célula.

Multiparametric Análise

Uma simulação de fluxo a citometria de dot-plot, plotagem de frente vs lado espalhados a partir de uma população de leucócitos., As populações celulares são marcadas pela sua identidade provável:

D restos presumidos, itens muito pequenos com baixa dispersão frontal e lateral.leucócitos/monócitos prováveis, células pequenas a médias com baixa complexidade/granularidade interna. Estas células geram uma média de dispersão para a frente e baixa intensidade do sinal de dispersão lateral

G granulócitos prováveis, grandes células com elevada complexidade interna/granularidade. Estas células geram sinais de dispersão para a frente e para o lado.,embora algumas identidades possam ser confirmadas por perfis de dispersão frontal e lateral, a rotulagem com um marcador específico de tipo celular sempre proporciona maior resolução e certeza ao traçar populações heterogêneas complexas de células.por exemplo, na parcela acima, um pesquisador pode ser capaz de distinguir entre granulócitos e linfócitos utilizando luz espalhada para a frente e para o lado. No entanto, três classes de granulócitos (neutrófilos, basófilos e eosinófilos) são muito semelhantes em tamanho e estrutura, dando-lhes propriedades similares de dispersão de luz., Neste caso, os neutrófilos podem ser seletivamente rotulados em virtude da sua expressão um marcador específico de neutrófilos como o Elano.

FACS: células separadoras baseadas em dados de citometria de fluxo

os Termos citometria de fluxo e triagem celular activada por fluorescência (FACS) são frequentemente utilizados indistintamente. Na prática, existem diferenças entre os dois métodos.

FACS é um derivado da citometria de fluxo que adiciona um grau excepcional de funcionalidade. Usando FACS um pesquisador pode fisicamente classificar uma mistura heterogênea de células em diferentes populações.,

usando anticorpos altamente específicos marcados com corantes fluorescentes, um pesquisador pode realizar análises FACS e simultaneamente recolher dados, e classificar uma amostra por um número quase ilimitado de diferentes parâmetros.

numa experiência FACS:

• espalhamento para a frente, dispersão lateral e fluorescentes são recolhidos dados, como na citometria de fluxo convencional.os parâmetros definidos pelo Utilizador fornecem informações sobre como as células devem ser ordenadas.com base nestes parâmetros, a máquina FACS usa um eletrodo para impor uma carga elétrica em cada célula.,ao sair da câmara de fluxo, os electroímanes irão separar as células por carga em recipientes separados.Qual é o aspecto dos dados da citometria de fluxo?

  em um experimento de citometria de fluxo, cada célula que passa pelo citômetro de fluxo e é detectada será classificada como um evento distinto.adicionalmente, a cada tipo de luz que é detectado pelo citómetro de fluxo (dispersão frontal, dispersão lateral e cada comprimento de onda de emissão de fluorescência) será atribuído o seu próprio canal único., Os dados da citometria de fluxo Irão traçar cada evento de forma independente, e representarão a intensidade do sinal de luz detectada em cada canal para cada evento.

  os dados da citometria de fluxo são tipicamente representados de uma de duas formas: histogramas, que medem ou comparam apenas um único parâmetro, e pontos-gráficos que comparam 2 ou 3 parâmetros simultaneamente em uma parcela de dispersão B ou tridimensional.

  um histograma normalmente traça a intensidade detectada num único canal ao longo de um eixo e o número de eventos detectados nessa intensidade está num eixo separado., Um grande número de eventos detectados em uma intensidade particular será exibido como um ponto no histograma.

  Por contraste, em um gráfico de pontos, cada evento é representado como um único ponto em uma parcela de dispersão. A intensidade de 2 canais diferentes (ou 3 canais diferentes num gráfico de três dimensões) é representada ao longo dos vários eixos. Os Eventos com intensidades semelhantes serão agrupados na mesma região no terreno de dispersão.nota: nos dados das parcelas em pontos, grandes amostras resultarão frequentemente num grande conjunto de eventos representados na mesma região da parcela., Existem muitos métodos para acrescentar uma resolução adicional a estas regiões. Por exemplo, um mapa de calor, como no exemplo acima, pode ser usado para fornecer informações sobre a densidade de eventos em uma determinada região da parcela.histogramas e Gráficos-Ponto ambos proporcionam diferentes vantagens para a análise dos dados da citometria de fluxo. Escolher a melhor forma de representar seus dados pode ajudar a garantir que ele conte uma história completa em um formato simples e compreensível.

  histogramas

  • são rápidos de ler e fáceis de compreender.
  • são mais úteis quando apenas um parâmetro (e.g., intensidade de um único canal fluorescente) é importante.a representação habitual inclui a intensidade de um único canal (eixo horizontal) versus o número de eventos detectados (eixo vertical).podem ser utilizados histogramas múltiplos sobrepostos para comparar um único parâmetro de duas populações de amostras diferentes (por exemplo, experimental vs. controlo).

  as parcelas com pontos

  • são mais úteis quando é necessário comparar dados multiparamétricos (por exemplo, intensidade da dispersão lateral vs canais de dispersão frontal).,
  • Pode ser duas ou três dimensões
  • A intensidade de cada canal é representada no seu próprio eixo.
  • Cada evento distinto é representado em um único ponto.
  • são uma representação mais complexa e ilustrativa dos dados.

  Dot-plots and histograms are not Mutual exclusive, and most complex flow cytometry experiments will make use of multiple plots to display rich, multi-parametric data on a sample.

  em muitos casos, mais de três parâmetros precisam ser plotados simultaneamente., Neste caso, uma técnica de análise de dados conhecida como gating pode ajudar a dar resolução adicional e flexibilidade, permitindo a análise de uma quantidade quase ilimitada de parâmetros simultaneamente em várias parcelas de dispersão e histogramas diferentes.

  Gating adiciona Resolução aos dados da citometria de fluxo

  Em suma, gating é um método para selecionar células de um experimento de citometria de fluxo que você deseja analisar em detalhes mais específicos., Gating permite que um pesquisador reúna e exiba mais informações sobre uma subpopulação de células do que poderia normalmente ser exibido em um ponto – plot de 2 ou 3 dimensões.

  Gating adiciona resolução a um experimento de citometria de fluxo, e permite a análise simultânea de um número quase ilimitado de diferentes parâmetros (canais).

  numa experiência de citometria de fluxo gabado:

  • um Utilizador recolhe dados de citometria de fluxo de um ou mais canais numa parcela em ponto.
  • Com base nos dados adquiridos, o utilizador desenha uma caixa de portas que selecciona uma subpopulação de células para análise posterior.,
  • A subpopulação de células dentro do portal será especificamente realçada em outros gráficos mostrando informações de canais alternativos.

  Gates adiciona uma incrível quantidade de flexibilidade à citometria de fluxo, concedendo até resolução de células únicas para cada canal disponível para o pesquisador. Múltiplos portões podem ser estabelecidos para uma única parcela de dispersão, e portões podem ser “empilhados” e combinados (ou seja, uma subpopulação de células para os canais 1 e 2 pode ser ainda mais fechado para os canais 3 e 4 para permitir mais especificidade e análise mais profunda).,

  Um exemplo de disparo

  Uma nota sobre a Compensação

  o Transbordamento de um canal para outro pode causar falsamente identificados como positivos os sinais. Spillover é o sinal artefactual que um corante fluorescente pode causar no canal de outro fluoróforo em função do seu brilho relativo e espectro de emissão. É aqui que entra em jogo a compensação. Compensação é um procedimento que isola o sinal de um determinado canal dos outros canais utilizados na mesma experiência. FITC e.g., tem seu pico de emissão na faixa verde do espectro eletromagnético. No entanto, também fluoresce no canal amarelo, onde o PE emite luz. Simplificando, a compensação subtrai o sinal FITC do canal PE.

  Este sinal no canal “errado” é subtraído do sinal causado pelo fluoróforo de interesse. Na amostra acima, a razão entre o componente verde e o componente amarelo num dado comprimento de onda de excitação é constante para o FITC., É assim possível inferir a quantidade de sinal amarelo não específico no canal PE a partir da medição no canal verde usando os coeficientes de compensação constante. O mesmo se aplica à transferência do PE para o canal FITC.