O CRISPR/Cas9 nucleases têm sido amplamente aplicados para o genoma de edição em diversos organismos. Os nucleases Cas9 complexos com um ARN-guia (Cas9-gRNA) encontram seus alvos digitalizando e interrogando o DNA genômico para sequências complementares ao gRNA., O reconhecimento da sequência de ADN-alvo requer um motivo adjacente ao protospacer (PAM) localizado fora desta sequência. Dado que a eficiência da localização do alvo pode depender da força das interacções que promovem o reconhecimento do alvo, aqui procurámos comparar afinidades de diferentes nucleases Cas9 para as suas sequências PAM cognatos., Para este fim, nós medido afinidades de Cas9 nucleases de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, e Francisella novicida complexado com guia de RNAs (gRNAs) (SpCas9-gRNA, SaCas9-gRNA, e FnCas9-gRNA, respectivamente) e de três engenharia SpCas9-gRNA variantes com a alteração da PAM especificidades para curto, PAM-contendo sondas de DNA. Usámos um ensaio” beacon “que mede as afinidades relativas das sondas de ADN, determinando a sua capacidade de afectar competitivamente a taxa de ligação Cas9-gRNA a derivados de ADN alvo com marcação fluorescente, chamados “beacons Cas9”.,”Observamos diferenças significativas nas afinidades para sequências de Pam cognato entre as enzimas Cas9 estudadas. The relative affinities of SpCas9-gRNA and its engineered variants for canonical and suboptimal Pam correlated with previous discovers on the efficiency of these PAM sequences in genome editing. Estes achados sugerem que a alta afinidade de uma nuclease Cas9 para o seu cognato PAM promove maior eficiência na edição do genoma.