Die CRISPR/Cas9-Nukleasen wurden für die Genombearbeitung in verschiedenen Organismen weit verbreitet angewendet. Cas9-Nukleasen, die mit einer leitenden RNA (Cas9-gRNA) komplexiert sind, finden ihre Ziele, indem sie die genomische DNA nach Sequenzen scannen und abfragen, die zur gRNA komplementär sind., Die Erkennung der DNA-Zielsequenz erfordert ein kurzes Protospacer-benachbartes Motiv (PAM), das sich außerhalb dieser Sequenz befindet. Angesichts der Tatsache, dass die Effizienz der Zielposition von der Stärke der Wechselwirkungen abhängen kann, die die Zielerkennung fördern, versuchten wir hier, Affinitäten verschiedener Cas9-Nukleasen für ihre verwandten PAM-Sequenzen zu vergleichen., Zu diesem Zweck haben wir Affinitäten von Cas9-Nukleasen aus Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus und Francisella novicida gemessen, die mit Guide-RNAs (gRNAs) (SpCas9-gRNA, SaCas9-gRNA und FnCas9-gRNA) und von drei engineered SpCas9-gRNA-Varianten mit veränderten PAM-Spezifitäten für kurze, PAM-haltige DNA-Sonden. Wir verwendeten einen“ Beacon „-Assay, der die relativen Affinitäten von DNA-Sonden misst, indem er deren Fähigkeit bestimmt, die Rate der Cas9-gRNA-Bindung an fluoreszenzmarkierte Ziel-DNA-Derivate, sogenannte „Cas9-Beacons“, kompetitiv zu beeinflussen.,“Wir beobachteten signifikante Unterschiede in den Affinitäten für kognitive PAM-Sequenzen unter den untersuchten Cas9-Enzymen. Die relativen Affinitäten von SpCas9-gRNA und seinen konstruierten Varianten für kanonische und suboptimale PAMs korrelierten mit früheren Befunden zur Effizienz dieser PAM-Sequenzen in der Genombearbeitung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine hohe Affinität einer Cas9-Nuklease zu ihrem verwandten PAM eine höhere Genombearbeitungseffizienz fördert.