evaluarea pulmonară. Testele funcției pulmonare (PFT) au fost efectuate cu un spirometru Brentwood în biroul nostru. Unii pacienți au fost supuși testelor în altă parte.
testarea imunitară. Testele au fost efectuate la Immunosciences Laboratoare sub conducerea lui A. Wojdani, Ph. d.. Având în vedere importanța acestor teste în contextul acestei evaluări, metodologia este descrisă în detaliu.,pentru a determina apariția conjugării s-a efectuat Compararea electroforetică și imunoelectroforetică a HSA, BSA cu F-HSA și F-BSA. Conjugarea a fost evidențiată prin mobilitatea modificată a F-HSA, F-BSA atunci când a fost comparată cu HSA sau, respectiv, BSA. Mai mult, numărul de grupuri amino add libere prezente în F-HSA sau F-BSA a fost determinat prin metoda Snyder și Sobocinski (1975) și a fost utilizat pentru a evalua cantitatea de substituție., Numărul grupărilor amino legate de formaldehidă a fost 26 pentru HSA și 31 pentru BSA. În acest calcul, a fost luată în considerare formarea reticulării intermoleculare.
prepararea conjugatelor toluen diisocianat-albumină serică umană (TDI-HSA) și albumină serică bovină (TDI-BSA):
Acest preparat a fost similar cu metodele lui Dewar și Baur (1982). Conform acestei metode, 1G HSA sau 1G BSA a fost dizolvat în 100 ml dintr-o soluție tampon conținând clorură de potasiu (0,05 mol/l), borat de sodiu (0,05 mol/l), PH 9,4 și răcit la 4 C. dioxan (10 ml) conținând 0.,15 ml de toluen diizocianat a fost apoi adăugat în picături în timp ce se agită pe o perioadă de 3 ore, urmată de adăugarea a 2 ml de etanolamină, centrifugare, filtrare prin dializă și liofilizare. Similar cu F-HSA și F-BSA, conjugarea a fost confirmată prin electroforeză și determinarea grupărilor amino libere prezente în conjugat. Numărul grupărilor amino legate de TDI a fost 37 pentru HSA și 43 pentru BSA. În plus, analiza spectrografică a conjugatului a fost efectuată în conformitate cu Zeiss et. al. (1980)., A existat o creștere semnificativă a absorbției de la 230 la 260 nm, ceea ce a indicat că TDI a devenit legat covalent de purtătorul de proteine. Această creștere în absorbția a fost de acord cu NH2 grup de determinare numai 76% pentru HSA și 81% pentru BSA
Pregătirea trimellitic anhidridă-albumină serică umană (TMA-HSA) și Trimellitic anhidridă albumină serică bovină (TMA-BSA):
Pentru a pregăti aceste conjugate 25 mg. TMA s-a dizolvat în 0,5 ml de dioxan și s-a adăugat în picături fie la 25 mg de HSA, fie la BSA dizolvată în 5 ml de NaHCO3 rece 7% în apă., După agitare timp de 60 minute la 4 C conjugatele au fost dializate împotriva a patru modificări de 0,1 M NaHCO3 și o schimbare de tampon. În cele din urmă conjugatele au fost filtrate și păstrate la -20 C până la utilizare. S-au efectuat analize ale TMA-HSA și TMA-BSA pentru a determina numărul de reziduuri de TMA legate de proteina purtătoare corespunzătoare. Concentrația proteinei purtătoare a fost transformată în concentrație molară cu greutatea moleculară a HSA și BSA. Din raportul dintre concentrația molară a ligandului TMA și purtătorul de proteine, s-a calculat raportul reziduurilor TMA pe molecule de purtător., S-a estimat că TMA-HSA conține 5 reziduuri de TMA per moleculă de HSA și pentru TMA-BSA șapte reziduuri per moleculă de albumină (Pien et al., 1988).
Prepararea de anhidridă ftalică-albumină serică umană (PA-HSA) și anhidridă Ftalică albumină serică bovină (PA-BSA) conjugați:
Aceste hapten-conjugate au fost preparate prin adăugarea de 75 mg de PA la o răcire cu soluție de 300 mg de HSA sau BSA în 100 ml H2O. Amestecul de reacție a fost agitat peste noapte, dialyzed împotriva 0,1 M PBS folosind tuburi cu un cutoff de 8000 de dalton. Folosind metoda lui Zeiss et. al. (1977) rapoartele molare au fost calculate., Rapoartele molare s-au dovedit a fi 22/28 pentru PA/HSA și 25/30 pentru PA/BSA.
prepararea conjugatelor cu inel benzenic HSA (B-HSA) și inel benzenic BSA (B-BSA):
pentru aceste preparate, 40 mg. de acid P-aminobenzoic a fost dizolvat în 2 ml de 1 n HCL și răcit prin imersie într-o baie de gheață. O soluție rece de 14 mg/ml a fost adăugată în picături. După fiecare adăugare, amestecul a fost agitat timp de 30 de secunde. În paralel, un gram de HSA sau BSA a fost dizolvat în acid boric 0,16 m tampon de clorură de sodiu (0-15 m) PH 9,0 (PH-ul a fost crescut cu NaOH)., Paharele care conțineau soluțiile de albumine erau înconjurate de o baie de gheață pe agitatorul magnetic. Soluția de sare de diazoniu a fost adăugată în picături, cu agitare rapidă la soluția de proteine reci. După adăugarea fiecărei picături, PH-ul este reajustat la 9,0 până la 9,5 cu un NaOH normal. Când toată soluția a fost adăugată, reacția a fost lăsată să continue cu agitare lentă timp de cel puțin o oră cu adăugări suplimentare de soluție de NaOH și menținerea PH-ului în intervalul de la 9,0 la 9,5., Moleculele mici nereacționate au fost îndepărtate prin dializă extinsă sau prin trecerea printr-o coloană de sephadex G-25 în camera rece, cu o soluție de sare izotonică ca tampon de elutare. Au fost efectuate analize ale dezvoltării culorii portocalii A B-HSA și B-BSA pentru a determina numărul de reziduuri B legate de proteina purtătoare corespunzătoare. Cantitatea de substituție B pentru HSA a fost de aproximativ 41, iar pentru BSA 53 (Migrdichian, 1957).determinarea anticorpilor: anticorpii specifici împotriva F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA și B-HSA au fost analizați printr-un test ELISA necompetitiv., Puțuri de plăci de microtitrare (Dynatech, Alexandria, VIRGINIA) au fost acoperite cu 100 1 de antigen soluții (100 g/ml) 0.1 M PBS PH 7,2 peste noapte la 4 ° C. Plăcile au fost spălate de 4 ori cu 0,1 M PBS conținând de 0,05% tween 20 între fiecare pas. Locurile de absorbție libere au fost blocate cu 2% albumină serică bovină fără protează la temperatura camerei timp de 4 ore și păstrate la -20 ° C până la utilizare.,
Proceduri Analitice:
procedura incluse următoarele: (1) spălarea de patru ori, (2) adaos de 100 1 de ser diluat (1:2 pentru IgE și 1:100 pentru IgM și IgG) în PBS tween-20, cu 1% BSA (3) incubare timp de 4 ore la 20 ° C, urmată de spălarea de 4 ori, (4) plus de 100 la 1 de o optime de diluare a fosfatazei alcaline etichetate afinitate purificat de capră anti-IgE uman ( ) (1:200), IgM (1:500) și anti IgG (1:1000), achiziționate de la KPI (Maryland) (5) incubare timp de 120 de minute la 20 ° C, (6) spălarea de 6 ori, (7) plus de 100 1 de P-nitrofenil fosfat (Sigma Chemical Co.,) (8) incubare timp de 60 minute la 20 C (9) adăugarea a 50 1 din 3 N soluție de hidroxid de sodiu și (10) citire duplicată. Rezultatele au fost calculate pe baza absorbțiilor probelor duplicate de 405 nm utilizând cititorul de microtitrare. Toate probele au fost citite împotriva unui antigen HSA ca un control al legării care nu este specific F-HSA, TDI-HSA, TMA-HSA, PA-HSA și B-HSA. Rezultatele au fost exprimate ca titru. Titrul este ultima diluție a serului care conferă absorbanță dublă față de controlul HSA.,
studii de specificitate și inhibare încrucișată:
pentru determinarea specificității anticorpilor a fost efectuat un studiu de inhibare încrucișată. Seruri pozitive pentru fiecare hapten-proteine conjugate au fost executați după caz incubare și în raport cu creșterea de zece ori trepte de hapten legat de HSA sau BSA ca inhibitori pentru a acoperi gama de anticorpi la antigenul exces. Acest interval a fost cuprins între 50 g și 1000 g pentru hapten-BSA și 80 g până la 1000 g pentru hapten-RSA., După incubare la 37 C și îndepărtarea precipitatului prin centrifugare, probele de înainte și după studiul de inhibare încrucișată au fost apoi plasate pe plăci cu godeuri acoperite cu conjugatul specific. Etapele ulterioare au fost urmate conform descrierii de mai sus pentru studiul ELISA.
IgG și IgM de anticorpi de legare la diferite conjugate a fost inhibată de hapten-HSA sau hapten-BSA din 36-85%. La o anumită concentrație, ambele hapten-HSA și hapten-BSA inhibată nivelul anticorpilor în maniere similare.,
inhibarea Parțială a IgE anticorpi de legare la diferite hapten conjugate a fost observată atunci când serul a fost pre-incubate cu hapten-HSA sau hapten-BSA. Această observație incompletă a inhibării anticorpului IgE a fost în principal legată de lipsa disponibilității serului cu titruri IgE ridicate împotriva diferitelor substanțe chimice din laboratorul nostru.,pe baza procedurilor de mai sus, au fost examinate 160 de probe donatoare de sânge de la indivizi sănătoși, de ambele sexe, cu vârste cuprinse între 22-55 de ani, pentru nivelurile de anticorpi împotriva F-HSA, TD-HSA, TMA-HSA, PA-HSA și B-HSA. Titrul mediu a fost 1:800 400 pentru IgG, 1:3200 1600 pentru IgM și 1:8 4 pentru IgE. Astfel, în titrurile noastre de laborator mai mari de 1:1600 pentru IgG, 1:6400 pentru IgM și 1:16 pentru IgE sunt considerate pozitive.,la un anumit pacient, creșterea sau scăderea titrurilor de anticorpi cu mai mult de o diluție a fost considerată semnificativă (vezi tabelele).
enumerarea subsetului de limfocite:
un singur Citometru cu flux laser (profilul Epics: Coulter Epics, Inc., Hialeah, FL) care discriminează împrăștierea luminii în unghi drept și în unghi drept, precum și două culori, a fost utilizat cu un pachet software (Quad Stat: Coulter). Populațiile de celule mononucleare au fost determinate prin imunofluorescență directă în două culori prin utilizarea unei tehnici de colorare a sângelui întreg cu anticorpul monoclonal adecvat și citometria fluxului (Fletcher et al.,, 1989) următoarele perechi de izotiocianat de fluoresceină (FITC), sau ficoeritrină (PE)-anticorpi monoclonali conjugați (Coulter imunologie) au fost selectate: T11-CDI/B4-FITC, T4-CDI/T8-FITC, T3-FITC/NKH-1-CDI și T11-FITC/Tal-PE pentru determinarea T-celulă/celule B, T-helper/T-supresor, NKHT3+ /NKHY3 și pentru cale alternativă de activare a limfocitelor respectiv.pentru a monitoriza markerii limfocitelor, au fost stabilite hărți bat pe populația de limfocite a scatter lumină în unghi față de o histogramă de dispersie a luminii de 90 de grade., A fost determinat procentul de celule colorate pozitiv pentru fiecare pereche de marker, precum și procentul de celule colorate dublu. Estimările numărului absolut de limfocite pozitive pentru markerii de suprafață respectivi au fost determinate prin înmulțirea numărului de celule limfocite periferice cu procentul de celule colorate pozitiv pentru fiecare pereche de markeri. De asemenea, a fost determinat procentul de celule dublu colorate., Estimările numărului absolut de limfocite pozitive pentru markerii de suprafață respectivi au fost determinate prin înmulțirea numărului de celule limfocite periferice cu procentul de celule pozitive pentru fiecare marker de suprafață.
Măsurarea anti-mielina bază de proteine anticorpi:
mielinei Umane bază de proteine (HMBP) a fost preparat prin metoda de Diebler et al. (1972) și verificată pentru puritate prin electroforeză în gel de poliacrilamină. Antiserul la HMBP a fost indus la iepuri prin injectarea repetată de HMBP în adjuvantul complet al lui Freund., Anticorpi activitate în seruri de iepure și pacientului probe a fost detectat, prin adăugarea de diferite diluții (1:100 la 1:10.000) de sera pentru puțuri de o placa de microtitrare anterior acoperite cu HMBP după cum urmează: HMBP 250 g/ml a fost dizolvat în carbonat de tampon, PH-ul 9.6 și 200 de litri de această soluție a fost adăugat în fiecare godeu. După incubare, spălare și blocare ca mai sus, 200 1 de iepure diluat sau ser uman au fost adăugate în godeuri. După incubare timp de o oră la 37 C serurile au fost scuturate din puțuri și apoi au fost spălate de 5 ori cu soluție de spălare., 200 1 de capră conjugată cu peroxidază anti-iepure sau capră Anti IgG uman, IgM sau IgA (diluție optimă) au fost adăugate în puțul corespunzător. După incubare și spălare repetată s-au adăugat 200 1 de substrat ABTS în fiecare godeu. Plăcile au fost incubate timp de o oră la temperatura camerei și citite într-un cititor de microtitrare la lungimea de undă 405 tun. Folosind antiseruri de iepure; a fost trasată o curbă de titrare și serul pacientului a fost comparat cu această curbă standard., Pe baza a peste 200 de controale și a determinărilor probelor pacienților, au fost considerați pozitivi litri mai mari de 1:2000 pentru IgA, 1:5000 pentru IgM și 1:8000 pentru IgG.